多肽合成技術多肽化學已經走過了一百多年的光輝歷程，1902年，EmilFischer首先開始關注多肽合成，由于當時在多肽合成方面的知識太少，進展也相當緩慢當時合成采用了苯甲酰，乙酰保護，脫去相當困難，而且容易導致肽鏈斷裂。1963年，Merrifield提出了固相多肽合成方法（SPPS），這個在多肽化學上具有里程碑意義的合成方法，一出來，就由于其合成方便，迅速，現在已經成為多肽合成的  方法，隨后的發展也證明了該方法不僅僅是一種合成方法，而且也帶來了有機合成上的一次革命，并成為了一支獨立的學科，固相有機合成（SPOS）。

進入21世紀，隨著蛋白質組學的研究深入，對于多肽化學的要求不僅僅是合成方法，而更多的集中在多肽標記與修飾方法，以及蛋白結構與功能模擬多肽的合成以及長肽或蛋白合成。多肽化學合成的基本介紹多肽化學合成方法，包括液相和固相兩種方法。液相合成方法現在主要采用BOC和Z兩種保護方法，現在主要應用在短肽合成，如阿斯巴甜，力肽，催產素等，其相對與固相合成，具有保護基選擇多，成本低廉，合成規模容易放大的許多優點。與固相合成比較，液相合成主要缺點是，合成范圍小，一般都集中在10個氨基酸以內的多肽合成，還有合成中需要對中間體進行提純，時間長，工作量大。固相合成方法現在主要采用FMOC和BOC兩種方法，它具有合成方便，迅速，容易實現自動化，而且可以比較容易的合成到30個氨基酸左右多肽。

1.氨基酸保護基

20種常見氨基酸，根據側鏈可以分為幾類：脂肪族氨基酸（Ala，Gly，Val，Leu，Ile，），芳香族氨基酸（Phe，Tyr，Trp，His），酰胺或羧基側鏈氨基酸（Asp，Glu，Asn，Gln），堿性側鏈氨基酸（Lys，Arg），含硫氨基酸（Cys，Met），含醇氨基酸（Ser，Thr），亞氨型基酸（Pro）。多肽化學合成中氨基酸的保護非常關鍵，直接決定了合成能夠成功的關鍵。因為常見的20中氨基酸中有很多都是帶有活性側鏈的，需要進行保護，一般要求，這些保護基在合成過程中穩定，無副反應，合成結束后可以*定量的脫除。合成中需要進行保護的氨基酸包括：Cys，Asp，Glu，His，Lys，Asn，Gln，Arg，Ser，Thr，Trp，Tyr。需要進行保護的基團：羥基，羧基，巰基，氨基，酰胺基，胍基，吲哚，咪唑等。其中Trp也可以不保護，因為吲哚性質比較穩定。當然在特殊的情況下，有些氨基酸也可以不保護，像 Asn，Gln，Thr，Tyr。

氨基酸側鏈保護基團非常多，同一個側鏈有多種不同的保護基，可以在不同的條件下選擇性的脫除，這點在環肽以及多肽修飾上具有很重要的意義。而且側鏈保護基和選擇的合成方法有密切的關系，液相和固相不一樣，固相中BOC和FMOC策略也不一樣，從某種意義上看，多肽化學就是氨基酸保護基的靈活運用與搭配。關于側鏈保護基的使用，請參考王德心的《固相有機合成——原理及應用指南》第四章，我們這里主要介紹Cys，Lys，Asp的幾種保護基及其脫除方法。Cys  見的保護基有三種，Trt，Acm，Mob，這三個保護基可以完成多對二硫鍵多肽的合成。Lys  見的保護基有：Boc，Fmoc，Trt，Dde，Allyl，這對于固相合成環肽提供了很多正交的保護策略。Asp  見的保護基有：Otbu，OBzl，OMe，OAll，OFm，同樣也提供了多種正交的保護策略。

2.多肽縮合試劑

目前多肽合成中，主要采用羧基活化方法來完成接肽反應，早使用的是將氨基酸活化為酰氯，疊氮，對稱酸酐以及混合酸酐的方法，但是由于這些條件下，存在氨基酸消旋，以及反應試劑危險以及制備比較復雜，逐漸被后來的縮合試劑取代，按照其結構可以分為兩種：縮合試劑主要有：碳二亞胺型，鎓鹽型（Uronium）。

主要包括：DCC，DIC， EDC.HCl等。采用 DCC進行反應，由于反應中生成的 DCU，在 DMF中溶解度很小，產生白 色沉淀，所以一般不用在固相合成中，但是由于其價格便宜，在液相合成中，可以通過過濾除去，應用仍然相當 廣泛。EDC.HCl因為其水溶解性的特點，在多肽與蛋白的連接中使用比較多，而且也相當成功。但是該類型的縮 合試劑的一個大的缺點， 就是如果單獨使用， 會有比較多的副反應， 但是研究表明如果在活化過程中添加 HOBt， HOAt等試劑，可以將其副反應控制在很低的范圍。

鎓鹽型縮合試劑反應活性高，速度快，現在使用非常廣泛，主要包括：HBTU，TBTU，HATU，PyBOP等。該試劑使用過程中需要添加有機堿，如，二異丙基乙胺（DIEA），N-甲基嗎啉（NMM），該試劑加入后，才能活化氨基酸。

3.多肽合成方法比較

液相多肽合成現在仍然廣泛的使用，在合成短肽和多肽片段上具有合成規模大，合成成本低的顯著優點，而且由于是在均相中進行反應，可以選擇的反應條件更加豐富，像一些催化氫化，堿性水解等條件，都可以使用，這在固相中，使用卻由于反應效率低，以及副反應等原因，無法應用。液相多肽合成中主要采用BOC和Z兩種反應策略。

固相多肽合成現在使用的主要有兩種策略：BOC和FMOC兩種。BOC方法合成過程中，需要反復使用TFA脫BOC，而且在后從樹脂上切割下來需要使用HF，由于HF必須使用專門的儀器進行操作，而且切割過程中容易產生副反應，因此現在使用受到實驗條件限制，使用也逐漸減少。FMOC方法反應條件溫和，在一般的實驗條件下就可以進行合成，因此，也得到了非常廣泛的應用。固相合成中樹脂，一般都是聚苯乙烯-二乙烯苯材料，大小在75-150μm，交聯度在1-2%之間，現在使用的大多是1%，因為這種交聯度下，樹脂在DMF，DCM中具有很好的溶脹性能，立體上是一個空間網狀結構，反應物分子可以在樹脂內部自由移動。樹脂中關鍵的部分是連接手臂，它一端連接在樹脂上，一端作為反應位點。目前廣泛使用的樹脂有：PAM，MBHA，Wang，2-Cl-Trt，Rink-Amide-MBHA等。其中PAM，MBHA是用在BOC策略中，因為其對酸非常穩定，需要在HF，TFMSA等強酸條件下才能夠切割下來。

4.非放射性核素標記

目前在非放射性核素標記中，使用廣泛的仍然是 C13，H2，因為其使用安全，放射性小。現在有比較*的非放射性標記的氨基酸，可以按照正常的多肽合成方法將標記好的氨基酸直接連接到多肽上。

5.熒光標記

熒光標記由于沒有放射性，實驗操作簡單。因此，目前在生物學研究中熒光標記應用非常廣泛，熒光標記方法與熒光試劑的結構有關系，對于有游離羧基的采用的方法與接肽反應相同，也采用 HBTU/HOBt/DIEA方法連接。但是對于 FITC 標記，需要在連接 FITC 前，增加一個氨基己酸，避免在切割的過程中被 TFA切割掉。

6.生物素標記

生物素 - 親合素系統 (biotin-avidinsystem ， BAS)，是 70年代后期應用于免疫學，并得到迅速發展的一種新型生物反應放大系統。由于它具有生物素與親合素之間高度親和力及多級放大效應，并與熒光素、酶、同位素等免疫標記技術有機地結合，使各種示蹤免疫分析的特異性和靈敏度進一步提高。主要有用于標記多肽氨基的生物素N-羥基丁二酰亞胺酯 (BNHS)和生物素對硝基酚酯 (pBNP)，其中以 BNHS   ，當然，也可以直接使用生物素也可以標記，因為其結構上有個游離的羧基， 采用 HBTU/HOBt/DIEA方法縮合，由于生物素的溶解度低， 使用 DMSO/DMF的混合溶劑增加溶解度。

總之，今后多肽化學的研究，不僅是將更多的有機化學合成新方法，新技術引入到多肽研究當中，而且對蛋白的結構以及功能模擬，開展結構活性研究（structureactivityrelationship）將是研究開發的熱點，因為這將為揭示蛋白的內在的生物活性本質提供大量實驗數據。

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