人角膜上皮細(xì)胞運(yùn)輸和保存

發(fā)送復(fù)蘇存人角膜上皮細(xì)胞方式：

（1）存活細(xì)胞，收到后應(yīng)繼續(xù)生長，傳代達(dá)到細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)。具體操作見細(xì)胞培養(yǎng)步驟。

（2）收到細(xì)胞后請拍照，3天內(nèi)如果發(fā)現(xiàn)污染，請及時(shí)拍照與我們溝通。

細(xì)胞接受后的處理：

1） 收到細(xì)胞后，請檢查是否漏液，如果漏液，請拍照片發(fā)給我們。

2） 請先在顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞生長狀態(tài)，去掉封口膜并將T25瓶置于37℃培養(yǎng)約2-3h。

3） 棄去T25瓶中的培養(yǎng)基，添加6ml新的*培養(yǎng)基。

4） 如果細(xì)胞長滿（90%以上）請及時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。

5） 接到細(xì)胞次日，請檢查細(xì)胞是否污染，若發(fā)現(xiàn)污染或疑似污染，請及時(shí)與我們?nèi)〉寐?lián)系。

細(xì)胞培養(yǎng)步驟

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1） 準(zhǔn)備基礎(chǔ)培養(yǎng)基100%；北美胎牛血清5%，添加劑1%；雙抗1%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

二． 細(xì)胞處理：

1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入250px皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

1）選用原代細(xì)胞生長狀態(tài)好（90－95％），生長數(shù)量大于5×105進(jìn)行傳代。

2）吸除原代細(xì)胞培養(yǎng)液。用含雙抗的1×PBS（pH7.4）清洗細(xì)胞培養(yǎng)瓶2次。

3）3ml細(xì)胞消化液加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，輕輕搖動(dòng)，使細(xì)胞消化液覆細(xì)胞培養(yǎng)瓶底。

注：推薦客戶用鈥HO原代細(xì)胞消化液。

4）細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于5%CO2、95%空氣、37oC培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)2分鐘后，在顯微鏡下觀察原代細(xì)胞的消化狀態(tài)。

請記住：如貼壁細(xì)胞逐漸趨于圓形、部分懸浮后，用手指輕輕拍打細(xì)胞培養(yǎng)側(cè)部至大部分貼壁細(xì)胞懸浮，加入3ml血清終止液，終止細(xì)胞消化。每種原代細(xì)胞的消化時(shí)間是有差異的。

5）吹打培養(yǎng)瓶中懸浮細(xì)胞若干次，再吸出細(xì)胞懸浮液，轉(zhuǎn)入15ml離心管中，1000rpm離心5分鐘。注：推薦客戶用鈥HO原代細(xì)胞培養(yǎng)體系。

6）棄離心管中液體，加入原代細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)，確定細(xì)胞數(shù)量。

7）細(xì)胞分瓶后，加入適量原代細(xì)胞培養(yǎng)液至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于5%CO2、95%空氣、37oC培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24小時(shí)。

下面T25瓶為類；

1，細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入1ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

2，4min 1000rpm 離心去掉上清。加1ml血清重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細(xì)胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存1ml細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。

3，將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。