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為何你的平板“空空如也”？感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的這幾個(gè)小細(xì)節(jié)你注意到了嗎？2025/04/09: 1.前言在分子克隆實(shí)驗(yàn)中，感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化是基因克隆的基礎(chǔ)步驟之一。但相信很多同學(xué)在涂板后，常常會(huì)出現(xiàn)平板上菌落稀少甚至“空空如也”的尷尬局面，這不僅耽誤我們的實(shí)驗(yàn)進(jìn)度，還會(huì)消耗寶貴的試劑和時(shí)間。實(shí)驗(yàn)為何會(huì)卡在這一步？本篇文章，將從幾個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)入手，一起和大家好好探討一下這個(gè)問題。2.感受態(tài)細(xì)胞“不給力”感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率直接決定了實(shí)驗(yàn)成敗。如果細(xì)胞本身質(zhì)量不佳，后續(xù)操作再完好也無濟(jì)于事。例如感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)常反復(fù)凍融或長期儲(chǔ)存（超過6個(gè)月），則很有可能會(huì)導(dǎo)致其活性顯著下降。感受態(tài)細(xì)胞是非常脆弱的，

細(xì)胞凋亡-早期凋亡檢測(cè)的優(yōu)選2025/04/08: Annexinv-PE/7-AADApoptosisDetectionkit-早期凋亡檢測(cè)的優(yōu)選紅色熒光標(biāo)記可與綠色熒光實(shí)現(xiàn)共染適用范圍:懸浮細(xì)胞、貼壁細(xì)胞保存條件：2-8°C保存產(chǎn)品概述在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜中的Ps由內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexinv是一種35-36KDa的ca2r依賴性磷脂結(jié)合蛋白,與Ps具有高度親和力,因此Annexinv被認(rèn)為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。使用藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的Annexinv作為探針,

細(xì)胞凋亡-更亮、更穩(wěn)定的紅色熒光2025/04/08: 抗淬滅因子高活性重組TdT酶,保證熒光摻入效率適用范圍:細(xì)胞樣品、石蠟切片、冰凍切片保存條件：-20°C保存；BrightRedLabelingMix避光儲(chǔ)存于-20°C產(chǎn)品概述本試劑盒采用TUNEL(TdTmediatedduTPNickEndLabeling)法,在TdT酶的催化下在凋亡細(xì)胞斷裂DNA的3'-羥基(3'-OH)末端催化摻入四甲基羅丹明-脫氧三磷酸尿苷(TMRred-duTP)。試劑盒對(duì)標(biāo)記反應(yīng)進(jìn)行了優(yōu)化,采用最佳比例的TMRred-duTP和未標(biāo)記的dNTP進(jìn)該"標(biāo)記尾巴減少

細(xì)胞凋亡--綠色熒光檢測(cè)凋亡2025/04/08: TUNELFITCApoptosisDetectionKit綠色熒光檢測(cè)凋亡綠色熒光標(biāo)記適用范圍：細(xì)胞樣品、石蠟切片、冰凍切片保存條件：-20°C保存；FITC-12-dUTPLabelingMix避光保存產(chǎn)品概述細(xì)胞凋亡的一個(gè)顯著特點(diǎn)是染色體DNA被內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶有規(guī)律的降解成長度約為180bp~200bp的整數(shù)倍片段。本試劑盒采用TUNEL(TdTmediatedduTPNickEndLabeling)法,用最佳比例的FITC-12-duTP和未標(biāo)記的dNTP進(jìn)行3'-OH末端的核苷酸摻入

細(xì)胞死亡的三種方式以及倆種凋亡細(xì)胞的檢測(cè)方法（Tunel、Annexin V）2025/04/01: 細(xì)胞死亡動(dòng)物細(xì)胞的死亡主要有三種方式：細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死和細(xì)胞自噬。目前對(duì)動(dòng)物細(xì)胞凋亡的特征、機(jī)制和生物學(xué)功能的研究較為深入。細(xì)胞凋亡也被稱為程序性細(xì)胞死亡(programmedcellDeath,PCD)。PCD最初是發(fā)育生物學(xué)中提出的概念,其含義是發(fā)育過程中發(fā)生的某類細(xì)胞的大量死亡,而這種細(xì)胞死亡要求特定的基因表達(dá)。細(xì)胞凋亡的典型特征是DNA規(guī)律性斷裂為180-200bp整數(shù)倍的片段,并暴露出3'-OH末端,在瓊脂糖凝膠電泳時(shí)呈現(xiàn)有規(guī)律的梯狀條帶。細(xì)胞壞死是區(qū)別于細(xì)胞凋亡的另一種典型死亡方式

分子克隆實(shí)驗(yàn)---第三章：測(cè)序結(jié)果解讀2025/04/01: 一代測(cè)序是克隆實(shí)驗(yàn)中常見的下游實(shí)驗(yàn)。現(xiàn)代DNA測(cè)序技術(shù)源于Sanger鏈末端終止測(cè)序法，其工作原理與Sanger測(cè)序不同的是4組反應(yīng)的雙脫氧核苷酸分別用不同的熒光分子標(biāo)記，每個(gè)試管的產(chǎn)物在光激發(fā)下發(fā)出不同顏色的熒光，延伸反應(yīng)和鏈終止完成后，將全部4組反應(yīng)物混合，在同一泳道進(jìn)行凝膠電泳，通過激光束激發(fā)熒光分析不同位置堿基的熒光顏色完成測(cè)序分析。一般情況下，測(cè)序信號(hào)文件多為*.ab1文件，該文件能夠得到每個(gè)堿基的測(cè)序峰型及整體質(zhì)量；*.seq文件則為ab1文件導(dǎo)出得到的測(cè)序結(jié)果序列，ab1文件中已具

分子克隆實(shí)驗(yàn)的流程及注意事項(xiàng)--四、定點(diǎn)突變2025/03/24: 四、定點(diǎn)突變定點(diǎn)突變引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增1.引物設(shè)計(jì)要求：5’-15-21bp反向互補(bǔ)區(qū)域+至少15bp非互補(bǔ)區(qū)域-3’，反向互補(bǔ)區(qū)域GC含量40%-60%，待突變位點(diǎn)至引物3’端Tm值60°C。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇對(duì)應(yīng)模塊進(jìn)行引物設(shè)計(jì)；2.建議使用試劑盒搭配的擴(kuò)增模塊進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并摸索退火溫度，優(yōu)化反應(yīng)體系和程序；3.PCR擴(kuò)增體系的模板質(zhì)粒投入量推薦50μl體系投入1ng，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)應(yīng)當(dāng)≤35個(gè)。擴(kuò)增產(chǎn)物DpnI消化和純化回收1.取5μl擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，判斷是否存在目的大小的

分子克隆實(shí)驗(yàn)的流程及注意事項(xiàng)--三、同源重組2025/03/24: 本方法適用于總長度（載體+所有片段）不超過20kb的重組實(shí)驗(yàn)。目的片段引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增1.2.1.引物同源臂設(shè)計(jì)要求：15-20bp(不計(jì)算酶切位點(diǎn))，GC含量40%-60%；根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇對(duì)應(yīng)模塊進(jìn)行引物設(shè)計(jì)；2.建議使用高保真酶進(jìn)行目的片段的PCR擴(kuò)增，并摸索退火溫度，優(yōu)化反應(yīng)體系和程序。載體線性化1.雙酶切：同時(shí)選擇兩種限制性內(nèi)切酶對(duì)載體質(zhì)粒進(jìn)行線性化處理。內(nèi)切酶選擇可參考第二章第一節(jié)內(nèi)容；2.單酶切：選擇一種限制性內(nèi)切酶對(duì)載體質(zhì)粒進(jìn)行線性化處理。內(nèi)切酶選擇可參考第二章第一節(jié)內(nèi)容；3

分子克隆實(shí)驗(yàn)的流程及注意事項(xiàng)--二、TOPO克隆2025/03/19: 二、TOPO克隆引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增1.目的片段PCR擴(kuò)增引物合成時(shí)，要求引物5’端不可磷酸化修飾；2.建議使用高保真酶進(jìn)行目的片段的PCR擴(kuò)增，并摸索退火溫度，優(yōu)化反應(yīng)體系和程序。PCR產(chǎn)物的純化回收1.PCR反應(yīng)后，產(chǎn)物應(yīng)當(dāng)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，判斷是否存在目的大小的條帶；2.推薦使用切膠回收的方式純化(切膠時(shí)間最好控制在3min內(nèi)，避免紫外照射對(duì)DNA的損傷)，回收濃度使用NanoDrop/OneDrop等儀器檢測(cè)，濃度應(yīng)當(dāng)≥30ng/μl，并跑膠鑒定是否僅存在目的條帶；3.回收濃度低時(shí)

分子克隆實(shí)驗(yàn)的流程及注意事項(xiàng)--一、酶切連接2025/03/18: 一、酶切連接一般來說，限制性內(nèi)切酶的選擇非常重要。建議從以下方面判斷選擇：1.限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列在目的載體中存在且只有一個(gè)，在目的片段中不存在；2.盡量選擇酶切產(chǎn)物為粘性末端、酶切效率高的限制性內(nèi)切酶，如BamHI、HindIII等；3.雙酶切時(shí)，注意緩沖液對(duì)兩種內(nèi)切酶的活性影響，可根據(jù)具體活性相應(yīng)調(diào)整酶量和反應(yīng)時(shí)間；若緩沖液不能同時(shí)滿足兩種酶的要求，需要分步酶切；4.單酶切時(shí)，建議對(duì)線性化載體進(jìn)行去磷酸化操作，減少載體自身環(huán)化的出現(xiàn)。注：酶切后，為防止載體自連，尤其當(dāng)酶切后產(chǎn)物末端可互補(bǔ)或

分子克隆實(shí)驗(yàn)解決方案-第一章：分子克隆實(shí)驗(yàn)概述2025/03/14: 第一章：分子克隆實(shí)驗(yàn)概述分子克隆技術(shù)是目前實(shí)驗(yàn)室常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一，研究者運(yùn)用該技術(shù)能夠?qū)NA片段以體外重組的方式構(gòu)建至載體，研究者運(yùn)用該技術(shù)能夠?qū)NA片段以體外重組的方式構(gòu)建至載體，隨后通過轉(zhuǎn)化操作導(dǎo)入合適的宿主中復(fù)制擴(kuò)增，最后篩選得到滿足實(shí)驗(yàn)需求的載體克隆。一、分子克隆實(shí)驗(yàn)方法分子克隆研究一般需要將特定DNA片段插入至載體形成重組質(zhì)粒。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模瑢⒊Ｒ姷姆肿涌寺〖夹g(shù)進(jìn)行分類：·入門克隆：TA克隆、TOPO克隆。·定向克隆：同源重組、酶切連接（黏性末端雙酶切反應(yīng)）。·定點(diǎn)突變：堿

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 的結(jié)果分析--實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 常用名詞2025/03/10: 校正染料(ROX)校正加樣誤差或孔與孔之間的誤差，提供一個(gè)穩(wěn)定的基線，極大地改進(jìn)定量的精確度，提高重復(fù)管之間的數(shù)據(jù)重現(xiàn)性。注意：不同的儀器對(duì)ROX的需求不同。基線PCR的最初幾個(gè)循環(huán)，在此基線上熒光信號(hào)幾乎沒有變化。閾值可以相信的最小熒光值。CT值擴(kuò)增曲線與閾值交點(diǎn)的橫坐標(biāo)。二、結(jié)果有效性判斷融解曲線單峰(染料法)擴(kuò)增曲線指數(shù)擴(kuò)增區(qū)域，復(fù)孔間CT值STD閾值設(shè)置合理閾值位于指數(shù)增長期：儀器會(huì)自動(dòng)計(jì)算閾值，但并非所有情況下儀器計(jì)算結(jié)果都是合理的，必要時(shí)進(jìn)行手動(dòng)調(diào)整。NTC確認(rèn)無氣溶膠污染或可以忽略

實(shí)時(shí)熒光定量PCR應(yīng)用及結(jié)果分析--相對(duì)定量和絕對(duì)定量2025/03/07: 第三章：實(shí)時(shí)熒光定量PCR的應(yīng)用一、相對(duì)定量測(cè)定不同樣品中基因表達(dá)量的相對(duì)值。內(nèi)參基因的選擇(1)始終選擇表達(dá)充沛、均一的基因做為內(nèi)參基因；(2)不要盲目選擇常用的內(nèi)參基因；(3)常用內(nèi)參基因：GAPDH，Actin，Tublin。內(nèi)參基因的選擇至關(guān)重要，決定結(jié)果的有效性加入內(nèi)參基因后：結(jié)果計(jì)算二、絕對(duì)定量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定樣品中基因表達(dá)量的絕對(duì)值(拷貝數(shù))。標(biāo)準(zhǔn)品：具有明確拷貝數(shù)濃度的樣品A/克隆質(zhì)粒B/PCR產(chǎn)物C/cDNA(擴(kuò)增效率測(cè)定等用途可以使用，絕對(duì)定量不能使用)拷貝數(shù)計(jì)算平均分子量（

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 操作流程及注意事項(xiàng)---FAQ2025/03/04: FAQ總RNA提取-酚氯仿抽提法RNA降解組織樣本保存不當(dāng)。RNA提取時(shí)需選擇新鮮組織或細(xì)胞樣本，若為凍存樣本，盡量避免反復(fù)凍融。樣品離開活體或原來的生長環(huán)境后，樣品中的內(nèi)源RNase開始降解RNA，降解速度與內(nèi)源RNase的含量及溫度有關(guān)。也可將新鮮組織充分浸泡在RNAKeeperTissueStabilizer(Vazyme#R501)中，組織可于室溫存放一周，4℃存放一個(gè)月或-20℃/-80℃長期保存。投入樣本較多，導(dǎo)致裂解不充分。RNA保存時(shí)間過久，發(fā)生降解。對(duì)提取的RNA進(jìn)行純度和完整

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 操作流程及注意事項(xiàng)---實(shí)時(shí)熒光定量 PCR2025/03/04: 實(shí)時(shí)熒光定量PCR操作流程概要基于SYBR染料法的qPCR反應(yīng)體系以Vazyme產(chǎn)品ChamQTMUniversalSYBR®qPCRMasterMix(Vazyme#Q711)為例組分自備材料ddH2O、1.5ml離心管、qPCR管冰或移動(dòng)冰盒操作流程（以ABIStepOnePlusTM為測(cè)試機(jī)型）基于Taqman探針法的qPCR反應(yīng)體系以Vazyme產(chǎn)品AceQ®UniversalU+ProbeMasterMixV2(Vazyme#Q513)為例組分自備材料ddH2O、1.5ml離心管、qP

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 操作流程及注意事項(xiàng)--逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)2025/02/27: 操作流程概要基于后期為qPCR的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系以Vazyme產(chǎn)品HiScript®IIIRTSuperMixforqPCR(+gDNAwiper)(Vazyme#R323)為例自備材料RNase-free1.5ml離心管、0.2mlPCR管冰或移動(dòng)冰盒組分操作流程2.配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系3.進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相關(guān)產(chǎn)品安培生物致力成為推動(dòng)生命科學(xué)進(jìn)步值得信賴的合作者深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術(shù)實(shí)力、先進(jìn)的經(jīng)營管理水平和完善的市場(chǎng)銷售體系的生物高科技企業(yè)。總部設(shè)在廣東，服務(wù)面向全國

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 操作流程及注意事項(xiàng)--RNA模板的制備2025/02/26: 一、RNA模板的制備常見的RNA提取的方法：傳統(tǒng)的酚CHCl?抽提法和柱式抽提法。操作流程概要酚CHCl?抽提法以Vazyme產(chǎn)品RNAisolaterTotalRNAExtractionReagent(Vazyme#R401)為例自備材料CHCl?，異丙醇，75%乙醇(DEPC水配制)，DEPC水組分樣本制備（過多的樣本量可能會(huì)導(dǎo)致樣本裂解不充分，并使產(chǎn)物純度降低；）1mlRNAisolater能夠充分裂解的最大樣本量如下：貼壁細(xì)胞（對(duì)于貼壁牢固的細(xì)胞可用細(xì)胞刮勺剝離細(xì)胞）1.棄培養(yǎng)液，PBS

實(shí)時(shí)熒光定量PCR總述2025/02/10: 第一章：實(shí)時(shí)熒光定量PCR總述一、實(shí)時(shí)熒光定量PCR的概念實(shí)時(shí)熒光定量PCR即Real-timePCR，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過CT值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。二、實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理A化學(xué)原理變產(chǎn)物DNA分子為熒光信號(hào)，通過測(cè)定熒光值即可反映產(chǎn)物DNA分子量。B數(shù)學(xué)原理通過循環(huán)數(shù)“n”(CT值)來計(jì)算起始DNA量。三、實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的選擇四、實(shí)時(shí)熒光定量PCR的優(yōu)勢(shì)比較不同樣品間某基因的“量”的方法：實(shí)時(shí)熒光定量PCR的優(yōu)點(diǎn)：(1)能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)

提取純化產(chǎn)品冊(cè)---09 樣本快速裂解（P073）2025/02/08: RoomTempTMSampleLysisKit(P073)室溫裂解試劑盒(P073)--保存條件:2~8℃保存●操作簡捷室溫3min即可，無需復(fù)雜模板提取●裂解效率高裂解試劑與傳統(tǒng)試劑盒提取基因組效果一致。●應(yīng)用廣泛兼容Taqman®探針法的SNP檢測(cè)，qPCR探針法定量，PCR擴(kuò)增等；樣本兼容廣：可裂解新鮮血液、凍存血液、常規(guī)抗凝劑血液、組織勻漿、口腔拭子、FTA卡等多種樣本產(chǎn)品概述RoomTempTMSampleLysisKit是一個(gè)簡單快速的血液室溫裂解試劑盒。本試劑盒包含LysisBu

提取純化產(chǎn)品冊(cè)---08 外泌體（R603）2025/02/08: VEX®ExosomeIsolationReagent(fromplasma)血漿外泌體提取試劑(R603)●操作簡單快捷無需超高速離心機(jī)，一步沉淀●兼容低量樣本起始樣本血漿量可低至500μl●產(chǎn)量穩(wěn)定可靠較低的離心力沉淀，獲得的外泌體結(jié)構(gòu)更完整，較傳統(tǒng)提取方法具有更高產(chǎn)量保存條件:VEXExosomeIsolationReagent(fromplasma)保存于2℃-8℃ProteinaseK保存于-15℃~-30℃產(chǎn)品概述本產(chǎn)品是專門用于分離血漿樣本中外泌體的試劑，只需通過簡單的較低速度離心

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