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賽默飛實時熒光定量pcr儀測定Tm值

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    2025年03月18日
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上傳者
杭州實了個驗生物科技有限公司
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資料簡介

使用賽默飛實時熒光定量PCR儀測定Tm值的原理與應用

一、引言

聚合酶鏈式反應(PCR)是一種廣泛應用于分子生物學、醫學診斷、食品安全和環境檢測等領域的核酸擴增技術。實時熒光定量PCR(Real-Time Quantitative PCR, qPCR)在傳統PCR的基礎上引入了熒光探針或染料,使得反應進程可以實時監測。熔解溫度(Tm,Melting Temperature)作為核酸雙鏈解鏈過程中的一個關鍵參數,能夠為引物特異性分析、突變檢測、產物鑒別等提供重要依據。

賽默飛科技生產的實時熒光定量PCR儀因其靈敏度、通量和數據分析能力,在多個實驗室中得到廣泛使用。本文將詳細介紹如何利用賽默飛實時熒光定量PCR儀進行Tm值的測定,并探討該過程的技術原理、實驗步驟及其應用價值。


二、Tm值的基本概念與意義

熔解溫度(Tm值)是指雙鏈DNA變性為單鏈時的溫度,此時有50%的雙鏈DNA分子解鏈。Tm值受DNA序列長度、GC含量、離子濃度、DNA濃度等因素影響。測定Tm值對于以下方面具有重要意義:

  1. 引物和探針設計優化:確保擴增的特異性和效率。

  2. 產物鑒別:通過熔解曲線識別不同的擴增產物或雜交探針的結合差異。

  3. SNP和突變檢測:通過微小Tm值差異區分單核苷酸變異。

  4. 驗證擴增特異性:避免非特異性擴增對結果造成干擾。


三、儀器原理與檢測機制

賽默飛的實時PCR系統通常采用SYBR Green I或TaqMan探針等熒光標記方式來監測DNA擴增。對于Tm值測定,多采用SYBR Green染料,其在雙鏈DNA存在時發出熒光,單鏈時熒光迅速降低。通過逐步升溫并記錄熒光變化,即可繪制出熔解曲線,進一步計算Tm值。

儀器通過以下機制測定Tm值:

  1. 熒光信號采集:在升溫過程中持續監測SYBR Green的熒光變化。

  2. 熔解曲線分析:熒光信號隨溫度升高而下降,取導數(-dF/dT)后得到Tm峰值。

  3. 軟件計算與輸出:賽默飛的軟件可自動識別Tm峰值并輸出精確數據。


四、實驗準備與操作步驟

1. 試劑準備

  • qPCR Master Mix(含SYBR Green)

  • 引物(Forward/Reverse)

  • 模板DNA

  • 無RNA酶水

2. 反應體系配置(以20 µL體系為例)

組分體積(µL)
SYBR Green Mix10
上游引物(10 µM)0.8
下游引物(10 µM)0.8
模板DNA1
無RNA酶水7.4
總計20

3. PCR反應程序設定

  • 初始變性:95℃,2分鐘

  • 循環步驟(40個循環):

    • 變性:95℃,15秒

    • 退火/延伸:60℃,30秒

  • 熔解曲線分析:

    • 起始溫度:60℃

    • 終止溫度:95℃

    • 升溫速率:0.3~1℃/s,持續監測熒光

4. 數據獲取與Tm值分析

  • 實時監測熒光并記錄擴增曲線

  • 啟動熔解曲線模塊,導出-dF/dT vs. T圖形

  • Tm值對應曲線峰值所在溫度


五、結果判讀與質量控制

1. 熔解曲線解析

  • 單一Tm峰:代表擴增產物高度特異,說明實驗設計合理。

  • 多重Tm峰:提示非特異擴增或引物二聚體存在,需優化引物或反應條件。

  • Tm值偏低或偏高:可能為GC含量異常或體系緩沖液濃度偏差。

2. 影響Tm值的因素

  • GC含量:GC對DNA穩定性貢獻高,Tm值隨GC比例升高而提高。

  • 引物長度:短引物Tm低,建議設計長度為18~25 bp。

  • 鹽濃度:高離子強度能穩定雙鏈DNA,提高Tm值。

  • DNA濃度:模板過多可能引起熔解曲線畸變。

  • 染料濃度與兼容性:需選擇適合儀器和應用的染料。


六、典型應用舉例

1. 突變檢測(如SNP分析)

通過引物或探針與目標序列結合后的Tm差異識別堿基突變。例如,某位點A→G突變可導致Tm值從78.5℃變為76.3℃。

2. 引物篩選

在多個候選引物中,通過測定Tm值及熔解曲線形態選出特異性強、產物純凈的引物組合。

3. 產物鑒定

針對擴增產物的Tm值進行比對,輔助確認擴增物是否為預期序列,尤其適用于無電泳分析條件下的高通量實驗。


七、注意事項與實驗優化建議

  • 引物設計軟件推薦使用Primer3、Oligo等,并確保Tm值相近(差值≤2℃)。

  • 設定熔解曲線前應關閉擴增熒光,以避免干擾。

  • 若發現Tm值波動較大,建議優化Mg2?濃度、PCR循環參數或更換試劑批次。

  • 對多重PCR反應,Tm值分布應盡量錯開,便于識別各目標產物。


八、結語

通過實時熒光定量PCR儀測定Tm值,實驗人員可以獲得關于擴增特異性、產物性質、突變識別等多方面的重要信息。賽默飛實時PCR平臺配合高分辨率熔解曲線分析功能,使得Tm值測定更為精準、穩定。該技術在基因分型、病原檢測、轉基因篩查等場景中已得到廣泛應用。合理利用這一工具,能夠顯著提高實驗效率與數據質量。


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