還原糖和總糖含量的測定

（3,5-二硝基水楊酸比色法）

一、目的

掌握還原糖和總糖定量測定的基本原理，學習比色定糖法的基本操作。

二、原理

    還原糖和總糖含量的測定是糖定量測定的基本方法。還原糖是指含有自由醛基或酮基的糖類，單糖都是還原糖，雙糖和多糖不一定是還原糖，其中乳糖和麥芽糖是還原糖，蔗糖和淀粉是非還原糖。利用糖的溶解度不同，可將植物樣品中的單糖、雙糖和多糖分別提取出來，對沒有還原性的雙糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有還原性的單糖進行測定，在分別求出樣品中還原糖和總糖的含量（還原糖以葡萄糖含量計）。

   還原糖在堿性條件下加熱被氧化成糖酸及其他產物，3,5-二硝基水楊酸則被還原為棕色紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內，還原糖的量與棕紅色物質顏色的深淺成正比關系，利用分光光度計，在540nm波長下測定光吸收值，查對標準曲線并計算，便可求出樣品中還原糖和總糖的含量。由于多糖水解為單糖時，每斷裂一個糖苷鍵需加入一分子水，所以在計算多糖含量時應乘以0.9。

三、實驗用品

（一）、實驗材料。

面粉

（二）、器皿

1、25mL刻度試管×11

2、大塑料離心管×1

3、100mL燒杯×1

4、100mL容量瓶×1

5、移液管：1mL×2,2mL×2

6、恒溫水浴鍋

7、沸水浴

8、離心機

9、電子天平

10、分光光度計

（三）、試劑

1、1mg/mL葡萄糖標準液：準確稱取100mg分析純葡萄糖（預先在80℃烘至恒重），置于小燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，定量轉移到100mL的容量瓶中，以蒸餾水定容至刻度，搖勻，冰箱中保存備用。

2、3,5-二硝基水楊酸試劑：將6.3 g 3,5-二硝基水楊酸和262mL 2mol/L NaOH溶液加到500mL含有185g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，在加5g結晶苯酚和5g亞硫酸鈉，攪拌至溶解。冷卻后加蒸餾水定容至1000mL，儲于棕色瓶中備用。

四、操作步驟

（一）、制作葡萄糖標準曲線

    取7支具有25mL刻度的刻度試管，編號，加入濃度為1mg/mL的葡萄糖標準液和3,5-二硝基水楊酸試劑。將各試管搖勻，在沸水中加熱5min，取出后立即放入盛有冷水的燒杯中冷卻至室溫，再以蒸餾水定容到25mL刻度處，用橡皮塞塞住試管口，顛倒混勻。在540nm波長下，用0號試管調零，分別讀取1～6試管的吸光值。以吸光值為縱坐標，葡萄糖質量（mg）為橫坐標，繪制標準曲線。

（二）、樣品中還原糖含量的測定

1、樣品中還原糖的提取

    準確稱取3g食用面粉，放在100mL的燒杯中，先以少量蒸餾水攪勻，置于50℃恒溫水浴中保溫20min，使還原糖浸出。然后轉入大塑料離心管中，4000r/min離心5min，上清液全部收集到100mL的容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，混勻，作為還原糖待測液。

2、總糖的水解和提取

    準確稱取1g食用面粉，放入100mL三角瓶中，加15mL蒸餾水及10mL6mol/L HCI，置沸水浴中加熱水解30min（水解是否*可用碘-碘化鉀溶液檢查）。待三角瓶中的水解液冷卻后，加入1滴酚酞指示劑，用6mol/L，NaOH中和至微紅色，用蒸餾水定容在100mL容量瓶中，混勻。將定容后的水解液過濾，取濾液10mL，移入另一100mL容量瓶中定容，混勻，作為總糖待測液。

3、顯色和比色

    取4支25mL刻度試管，編號。分別加入待測夜和顯色劑，空白調零可使用制作標準曲線的0號試管。加熱、定容和比色等其余操作與制作標準曲線相同。

五、附注

1、離心比過濾易得上清液

2、標準曲線制作與樣品含糖量測定應同時進行，一起顯色和比色。