導(dǎo)讀：構(gòu)建高產(chǎn)細(xì)胞株的基本步驟為轉(zhuǎn)染-篩選-擴(kuò)增-單克隆化-篩選-馴化。
   首先，通過質(zhì)粒將目的蛋白的編碼基因?qū)氲郊?xì)胞內(nèi)。質(zhì)粒上除了目的基因外還帶有抗性基因，比如抗生素抗性基因。這樣在轉(zhuǎn)染后就可以利用選擇壓力富集整合質(zhì)粒的細(xì)胞。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中質(zhì)粒不能進(jìn)行復(fù)制，未整合到基因組中的質(zhì)粒隨著細(xì)胞分裂逐漸丟失。在一段時(shí)間的選擇壓力后，所有存活下來的細(xì)胞基因組中都整合了外源質(zhì)粒。
   獲得了一系列整合了外源基因的穩(wěn)定細(xì)胞后，接下來就需要從中篩選出表達(dá)量zui高的克隆。zui常用的方法是檢測(cè)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中蛋白的濃度；另外一個(gè)方法是讓細(xì)胞在軟瓊脂上生長(zhǎng)形成集落，然后利用原位免疫沉淀技術(shù)獲得高產(chǎn)細(xì)胞。近年來，發(fā)展起來的高通量自動(dòng)化篩選技術(shù)也被受關(guān)注。
   為實(shí)現(xiàn)克隆的高表達(dá)，在有些情況下外源基因擴(kuò)增，比如以CHO用作宿主細(xì)胞；有些情況則不需要，比如雜交瘤細(xì)胞。為了實(shí)現(xiàn)外源基因的擴(kuò)增，將細(xì)胞在高濃度的擴(kuò)增標(biāo)記（比如dhfr）抑制劑的壓力下生長(zhǎng)。細(xì)胞存活需要擴(kuò)增標(biāo)記。高濃度的抑制劑能夠殺死除擁有多個(gè)擴(kuò)增標(biāo)記基因以外的絕大多數(shù)細(xì)胞。在標(biāo)記基因擴(kuò)增的過程中，與它相鄰的基因也隨之發(fā)生擴(kuò)增。基因拷貝數(shù)的增加導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的提高。在這個(gè)過程中，某些高產(chǎn)細(xì)胞株重組IgG重鏈的轉(zhuǎn)錄水平成為細(xì)胞內(nèi)zui高。另一方面，過高的蛋白表達(dá)可能會(huì)超過細(xì)胞內(nèi)蛋白折疊的限度，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)生未折疊蛋白效應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此沒有建立起與高表達(dá)相匹配的其它結(jié)構(gòu)的細(xì)胞可能不能存活。
     基因擴(kuò)增后的細(xì)胞既含有多個(gè)拷貝的外源基因，能高水平的表達(dá)目的基因和抗性基因，還具備了強(qiáng)大的蛋白分泌能力。除此之外，高產(chǎn)細(xì)胞株還應(yīng)具備高密度培養(yǎng)和能維持較長(zhǎng)平臺(tái)期的能力。
    基因擴(kuò)增后的細(xì)胞可以視為一個(gè)細(xì)胞“Pool”，其中含有眾多不同遺傳背景的細(xì)胞，或是基因插入位點(diǎn)的不同，或是擴(kuò)增程度的不同等等。因此基因擴(kuò)增后下一步是細(xì)胞的單克隆化。單克隆化是利用流式細(xì)胞儀或有限稀釋法或其他自動(dòng)化方式(0.2個(gè)細(xì)胞/孔)將細(xì)胞接種到多孔板中。可以認(rèn)為從某一特定孔里長(zhǎng)出的細(xì)胞都是由早期的一個(gè)細(xì)胞分裂而來，他們?cè)谶z傳上是同源的。
     單克隆化后需要對(duì)獲得的細(xì)胞株進(jìn)行初步的評(píng)價(jià)。主要包括生長(zhǎng)特性，產(chǎn)品質(zhì)量的評(píng)價(jià)。有些情況下需要將細(xì)胞馴化到更接近生產(chǎn)模式的條件下，進(jìn)行培養(yǎng)。
     單克隆化細(xì)胞株構(gòu)建過程中的關(guān)機(jī)環(huán)節(jié)。通常不管是否進(jìn)行基因擴(kuò)增都應(yīng)進(jìn)行細(xì)胞的單克隆化。盡管用于構(gòu)建細(xì)胞株的宿主細(xì)胞都是非整倍體，傾向于進(jìn)行基因組重排和表觀遺傳學(xué)的改變；但是單克隆化獲得的細(xì)胞在同源性上遠(yuǎn)高于細(xì)胞“Pool”。從單個(gè)細(xì)胞開始到生產(chǎn)環(huán)節(jié)結(jié)束，細(xì)胞大概需要進(jìn)行60次分裂；如果算上整個(gè)產(chǎn)品的市場(chǎng)壽命，細(xì)胞至少需要80次分裂。通過單克隆化可以防止zui初細(xì)胞“Pool”里發(fā)生突變或產(chǎn)量低細(xì)胞成為優(yōu)勢(shì)群體，逐漸取代高產(chǎn)細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞不穩(wěn)定。