分光光度計的結構與使用方法
- 分光光度法定義、特點與應用
1.1 定義: 分光光度法是利用物質所*的吸收光譜來鑒別物質或測定其含量的分析檢測技術.
1.2 特點: 靈敏,,快速和簡便,在復雜組分系統中,不需要分離,即能檢測出其中所含的極少量物質.
1.3 應用: 生物、化學研究中廣泛使用的方法之一,廣泛用于糖,蛋白質,核酸,酶等的快速定量檢測. - 分光光度計的分類
紅外分光光度計: 測定波長范圍為大于760 nm的紅外光區
可見光: 測定波長范圍為400~760 nm的可見光區
紫外: 測定波長范圍為200~400 nm的紫外光區
- 工作原理
人眼可見的光只占電磁波譜的很小—部分(400~760nm)
它是一種頻率較大的電磁波.電磁波按頻率大小,從頻率zui小的無線電波到頻率zui大的γ-射線排成一列,即組成電 磁波的波譜.
2.2.1 的光譜范圍
包括波長范圍為400~760 nm的可見光區和波長范圍為200~400 nm的紫外光區.不同的光源都有其*的 發射光譜,因此可采用不同的發光體作為儀器的光源.
鎢燈的發射光譜:鎢燈光源所發出的400~760nm波長的光譜,光通過三棱鏡折射后,可得到由 紅,橙,黃,綠,藍, 靛,紫組成的連續色譜;該色譜可作為可見光的光源.
氫燈的發射光譜:氫燈能發出185~400 nm波長的光譜,可作為紫外光光度計的光源.
2.2.2 物質的吸收光譜(1)
如果在光源和棱鏡之間放上某種物質的溶液,此時在屏上所顯示的光譜已不再是光源的光譜,它出現了幾條暗線, 即光源發射光譜中某些波長的光因溶液吸收而消失,這種被溶液吸收后的光譜稱為該溶液的吸收光譜.
不同物質的吸收光譜是不同的.因此根據吸收光譜,可以鑒別溶液中所含的物質.
2.2.2 物質的吸收光譜(2)
當光線通過某種物質的溶液時,透過的光的強度減弱.因為有一部分光在溶液的表面反射或分散,一部分光被組成 此溶液的物質所吸收,只有一部分光可透過溶液.
入射光 = 反射光 + 分散光 + 吸收光 + 透過光
如果我們用蒸餾水(或組成此溶液的溶劑)作為"空白"去校正反射,分散等因素造成的入射光的損失,則:
入射光 = 吸收光 十 透過光
2.2.3 物質吸光度(A)與透射比(T)的關系
設 I0 為經過空白校正后入射光的強度;I 為透過光的強度.
根據實驗得知 I = I0 ?10-εc l
式中,c 表示吸收物質的摩爾濃度;l 表示吸收物質的光徑,用cm表示;ε表示吸收物質的摩爾消光系數,它表示物 質對光的吸收特性,不同物質的ε數值不同. 所以 I / I0 = 10-εc l
令 T(透射比) = I / I 0 T = 10-εcl
若以T對吸收物質的濃度作圖,則得圖1-5-2中的曲線.
由上式可得 1g(1 / T) = εc l
lg(l / T)為物質的吸光度(A) A = 1g(1 / T)
2.2.4 Lambert -Beer定律( E = εc l)
上式說明了物質的吸光度與吸收物質的濃度和液層的厚度成正比,這就是光吸收的基本定律--Lambert-Beer(朗伯-比耳)定律.
- 的基本結構
無論哪一類都包括 :光源,單色器,吸收池,檢測器和測量儀表5個基本部件
4.1 的基本部件(1):
光 源: 上常用的光源有兩種:鎢絲燈或氫燈,在可見光區,近紫外光區和近紅外光區常用鎢絲燈作為光 源;在紫外光區多使用氫弧燈.
單色器:把混合光波分解為單—波長光的裝置.在中多用作為色散元件.
吸收池比色杯,比色皿,比色池)一般由玻璃,石英或熔凝石英制成,用來盛被測的溶液.在低于350 nm的紫外光區 工作時,必須采用石英池或熔凝石英池.
4.2 的基本部件(2):
吸收池(比色皿)必須與光束方向垂直.此外,每套比色皿的質料,厚度應*相同,以免產生誤差.比色皿上的指紋, 油污或壁上的沉積物都會顯著地影響其透光性,因此在使用前務必*清洗.
常用光電池,光電管和光電倍增管三種.
測量裝置 —般常用的紫外光和可見光有3種測量裝置,即電流表,記錄器和數字示值讀數單元.現代的 儀器常附有自動記錄器,可自動描出吸收曲線.
4.3 檢測器
棱鏡與光柵
棱 鏡: 光波通過棱鏡時,不同波長的光折射率不同;因而能將不同波長的光分開.玻璃對紫外線的吸收力強,故玻 璃棱鏡多用于可見光.石英棱鏡可在整個紫外光區傳播光,故在紫外光中廣為應用.
衍射光柵: 在石英或玻璃表面上刻劃許多平行線(每英寸約刻15 000—30 000條).由于刻線處不透光,通過光的 干涉和衍射使較長的光波偏折角度大,較短的光波偏折角度小,因而形成光譜.
光源照到棱鏡(或光柵)以前,先要經過一個入射狹縫,再通過平行光鏡使成為平行光束投到棱鏡上.透過棱鏡的光 再經另一聚光鏡,在此聚光鏡的焦面內可得一清楚的光譜圖.如在焦線處放—出射狹縫,轉動棱鏡使光譜移動,就 可以從出射狹縫射出所需要的單色光.整個裝置稱為"單色器"
1) 檢測器---光電池
光電池裝在一個特制的匣子里面由3層物質組成的圓形或長方形薄片.*層是一種導電性良好的金屬,這是光 電池的負極.中間極薄的一層是半導體硒,第3層是鐵,這 是光電池的正極.當光電池受光照射以后,半導體硒的表 面逸出電子,這些電子只向負極方向移動,而不向正極移動,因此在上下兩金屬片間產生一個電位差,線路連通時 即產生電流
2) 檢測器---光電管
光電管 光電管是由封裝在真空透明封套里的一個半圓柱型陰極和一個絲陽極組成.陰極的凹畫上有一層光電發 射材料,此種物質經光照射可發射電子.當在兩極間加有電位 時,發射出來的電子就流向絲陽極而產生光電流.對 于相同的輻射強度,它所產生的電流約為光電池所產生電流的1/4.由于光電管具有很高的電阻,所以產生的 電 流容易放大 .
3) 檢測器---光電倍增管
光電倍增管 它比普通的光電管*,它可將*次發射出的電子數目放大到數百萬倍 .當電子打在兼性陽極上 時,能引起更多的電子自表面射出.這些射出的電子又被第二個兼性陽極所吸引,同樣再產生更多的電子.
此過程重復9次后,每個光子可形成106~107個電子.這些電子zui后被收集在陽極上.所得到的倍增電流可進一 步加以放大和測量.
- ,帶寬是什么概念,是越寬越好嗎?
通常指狹縫寬度,表現為圖譜的半峰寬,帶寬越小,定性時峰位越明顯。某種意義上可理解為儀器的分辨率,理 論上越小越好,但實際由于儀器噪聲的影響,帶寬越小噪聲越大,故需要選擇合適的帶 寬,一般選擇2nm-5nm的帶寬來 測試樣品(自然界中99%的樣品都能準確的測量出).所以購儀器一般要選5nm以下帶寬的儀器. 但是,帶寬太小,光通量就很小,在分析中也不適用。的選擇是帶寬可調的儀器,根據自己的實際需要來調整帶寬。
- 狹縫寬度和光譜帶寬的關系
狹縫寬度是毫米級的,是光度儀器加工時的物理尺寸;光譜帶寬是nm級的,是儀器的重要分光指標,是決定 儀器的分光能力的重要設計指標。通俗的講光譜帶寬就是通過狹縫的光所包含的譜帶寬度,是決定儀器分光的 純度以nm表示。所以狹縫越窄,光譜帶寬越小,但不是指只要將狹縫變窄就能達到光譜帶寬小,必須同時其 他硬件條件(包括光源/光柵/檢測器以及機械系統等)達到這個級別。
- 專家支招:如何選擇紫外?
主要考慮光學構造、光譜范圍、樣品類型和分析工具。
研究者們有眾多的新紫外光可選。自從60年前紫外出現在實驗室的工作臺之后,這種能 解決廣泛難題的儀器可以從單一波長的測量到高性能多光譜進行測量分析。
1;科學家們選擇時需要根據自己實驗 室的需要和目的用途來考慮
2;光學構造和光源
3;探測方法
4;樣品類型
4;數據處理
5;其他要考慮的用戶需求因素
光學構造(OPTICAL CONFIGURATION)
一般來說,紫外光分為單光束和雙光束兩類。顧名思義,單光束型主要是依賴單束光進行測量。一 束給定波長的光通過對照物,然后再通過實際樣品溶液,就能得到吸光結果。
雙光束型則是通過一個斬光輪(mirrored chopper wheel)將一束光分成兩束,分別測量對照樣品和實際樣品。 可以zui小化光漂移(lamp drift)和減少測量時間。一些雙光型光度計不利用斬光輪,而是利用一種光束分光器 來代替,將一束光分成兩束平行的光然后同時測量對照樣品和目的樣品。因為增加了測量的速度,所以雙光束 在測量一些溶液隨時間動態變化的研究中大有用處。
光源和檢測方法(LIGHT SOURCES AND DETECTION)
的光譜也是需要考慮的一個重要因素。實驗室研究人員希望省錢購入專門儀器定量核酸、蛋白或者 細菌的生長情況。例如Amersham Biosciences of Piscataway公司的GeneQuant II能在230、260、280、 320、595和600nm的波長下測量樣品。如果需要更大的靈活性,研究者可以考慮一種更高性能的寬光譜儀 器,可以程序性地進行ELISAs分析和比色分析。
紫外一般覆蓋190nm和380nm波長,通常利用氘燈照明。一些特殊的儀器可以提供滿足光子學 和半導體研究需要的光譜范圍。Varian of Palo Alto公司的Cary Deep UV和Hitachi High Technologies of Tokyo的U-7000 Automated Vacuum UV System就是這樣的儀器。
一些儀器具有多種光源供選擇:紫外光、可見光和甚至紅外光(780 nm 至3,000 nm)。鎢燈和鹵素燈一般只 覆蓋可見光部分(大約380 nm 到800 nm)。而氙燈則可以覆蓋紫外光和可見光區域。
的帶寬(bandwidth)很大程度上依賴于單色儀的狹縫的寬度。可以投射出實驗要求的光譜。 一種嚴格帶寬使得儀器能對復雜的混合物進行高分辨率的吸光測量。可變的單色儀的狹縫寬度能使一臺分光光 度計滿足多種實驗需要。
為了測量吸光值,制造商通常使用光電倍增管(photo-multiplier tubes,PMTs)和光敏二極管。 PMTs提供快速的反應時間和良好的靈敏度,并且可以在紫外光譜調節至特定的范圍。但一些制造商依賴于光 敏二極管的動態范圍在數秒內行使所有的光譜測量。
樣品類型(SAMPLE FORMAT)
在大部分的樣品類型中,可接受樣品孔、小玻璃管cuvette、吸漿管和微孔板。微孔板主要是滿足高 通量的需要和大規模的實驗室需求。但盡管對于小實驗室來說,制造商仍然提供了多種容器轉換器來滿足通量 的要求和減少實驗時間。
用小試管cuvette裝樣品容量一般從1 μl-5ml,并且一些儀器裝備了各種樣品固定物來滿足各種改變需要。體 現了柔韌性。
數據管理(DATA MANAGEMENT)
大部分單機型的包含了驅動儀器運行和管理數據的軟件。高性能的儀器,通常與PC機一起聯用,需要從制造商提供額外的軟件。同時用戶也可以選擇升級軟件以滿足他們的需要。
另外一個值得考慮的因素是數據的zui終使用。各獨立實驗室都有各自感興趣的實驗結果。例如一些藥物機構需 要考慮美國FDA的要求和歐聯盟的藥物評價機構的要求選擇不同的數據處理方式。
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