免疫組化，是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理--抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì))，對其進(jìn)行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry)或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(immunocytochemistry)，也是國內(nèi)應(yīng)用比較廣泛的一種方法，這個實(shí)驗(yàn)的成敗有兩個比較關(guān)鍵的因素，樣本的處理和抗體的選擇，今天上海勁馬就為您介紹一下怎樣處理免疫組化樣本的處理和抗體的選擇，今天就讓上海恒遠(yuǎn)與您一起分享一下怎樣處理免疫組化的樣本。

對于ICC實(shí)驗(yàn)，在開始染色步驟之前，細(xì)胞必須附著在顯微鏡載玻片或蓋玻片上。樣本制備也與固定方法密切相關(guān)，而固定方法又會受到檢測技術(shù)（熒光 vs 顯色）的影響。

在大部分情況下，某個實(shí)驗(yàn)變量將決定樣本制備的zui合適方法。例如，浸潤固定在甲醛中的組織必須石蠟包埋，并利用切片機(jī)切片。或者，為了檢測磷酸化依賴的表位，組織可能需要快速冷凍，因此在醇類固定之后就需要一個低溫箱來進(jìn)行樣本切片。

石蠟包埋的組織

石蠟包埋為長期保存組織樣本提供了合適選擇。組織在用石蠟包埋之前必須固定。固定可通過灌注或解剖后立即浸潤來實(shí)現(xiàn)，一般需要4-24小時。不建議固定組織24小時以上，因?yàn)楣潭ㄟ^度可能導(dǎo)致抗原的遮蔽。如有必要，組織在固定后可轉(zhuǎn)移至酒精中，直至包埋過程。

因?yàn)槭炁c水是不混溶的，所以組織在加入熔化的固體石蠟前必須脫水。脫水是通過浸潤在濃度遞增的酒精中而實(shí)現(xiàn)的。這種方法逐步改變疏水性，讓細(xì)胞傷害zui小化。脫水之后，組織與二甲苯共同孵育，以去除任何殘留的酒精。石蠟一般加熱到60?C進(jìn)行包埋，隨后經(jīng)過一夜硬化。之后利用切片機(jī)用鋒利的刀片將組織切成超薄的切片。切片在顯微鏡載玻片上干燥，并長時間室溫儲存。組織切片在開始IHC/ICC步驟之前必須再水化。石蠟是組織包埋的*也是zui常用的物質(zhì)。不過，組織也可包埋在塑料中，凝固得更硬，并切成更薄的組織切片（1.5μmvs 5μm）。

冰凍組織

冰凍組織樣本的好處之一是省去了石蠟包埋組織zui初所需的固定步驟。在檢測翻譯后修飾如磷酸化時，快速冷凍特別有益。冰凍組織的制備可將組織浸潤在液氮或異戊烷中，或埋在干冰里。對于冰凍組織，在冷凍和切片之后進(jìn)行一個短時間的固定。冰凍組織切片zui常用醇類固定，這避免了修復(fù)甲醛交聯(lián)所遮蔽的表位的需要。冰凍組織在低溫箱中切片，切片在-80?C可儲存多達(dá)1年。

冰凍組織切片的處理時間比石蠟包埋切片要短一些。不過，冷凍對于組織的長期保存是不夠的，且細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成可能會負(fù)面影響亞細(xì)胞的細(xì)節(jié)。此外，冰凍切片通常比石蠟切片厚。這可能導(dǎo)致較低的顯微鏡分辨率以及差的組織形態(tài)學(xué)圖像。因?yàn)楸鶅銮衅ǔ１Ａ裘傅幕钚?，所以封閉可能影響IHC檢測的內(nèi)源酶的活性也是特別重要的。

細(xì)胞樣本

在開展ICC研究時，首先必須將細(xì)胞附著在固體支持物上，如顯微鏡載玻片或蓋玻片。這對于貼壁細(xì)胞很簡單，它們可直接放置在6孔或24孔板底部的無菌蓋玻片上生長。將蓋玻片預(yù)包被一層帶電荷的聚合物（如多聚賴氨酸）和/或細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（如層粘連蛋白、纖維粘連蛋白或膠原），可增強(qiáng)細(xì)胞附著。染色過程的所有步驟可在微孔板內(nèi)的蓋玻片上開展，向每個孔中加入適當(dāng)?shù)娜芤翰⒁谱呷芤?。懸浮?xì)胞可通過Cytospin?離心或與包被多聚賴氨酸的玻片孵育10分鐘而附著在玻片上。

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