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慢病毒載體構(gòu)建,包裝,純化技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)

來源:上海乾思生物科技有限公司   2015年08月01日 15:27  

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簡介:世界*品牌慢病毒載體構(gòu)建,包裝,純化技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)原裝,質(zhì)量保證,*。
慢病毒載體構(gòu)建,包裝,純化技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
我們具備豐富的蛋白表達(dá)設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)操作技巧,承諾客戶不成功不收費(fèi)。我們所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)可信,我們提供原始的表達(dá)菌株和克隆質(zhì)粒,客戶可以依據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)報(bào)告重復(fù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
產(chǎn)品品牌:   http://www.。。com/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html    
測序?qū)嶒?yàn)流程:
慢病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種,具有逆轉(zhuǎn)錄病毒的基本結(jié)構(gòu)和特性:整合入宿主細(xì)胞基因組,長期表達(dá),可用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備;但也有不同于逆轉(zhuǎn)錄病毒的組份和特性:比逆轉(zhuǎn)錄病毒具有更高的滴度,不僅可以感染分裂期細(xì)胞,更重要的,還能感染非分裂期的細(xì)胞。利用慢病毒載體,可以研究啟動(dòng)子的調(diào)控、過表達(dá)特定基因或沉默特定基因。
(一) 實(shí)驗(yàn)流程(1和2為并列步驟)
1.慢病毒過表達(dá)質(zhì)粒載體的構(gòu)建
設(shè)計(jì)上下游特異性擴(kuò)增引物,同時(shí)引入酶切位點(diǎn),PCR(采用高保真KOD酶,3K內(nèi)突變率為0%)從模板中(CDNA質(zhì)粒或者文庫)調(diào)取目的基因CDS區(qū)(coding sequence)連入T載體。將CDS區(qū)從T載體上切下,裝入慢病毒過表達(dá)質(zhì)粒載體。
2.慢病毒干擾質(zhì)粒載體的構(gòu)建
合成siRNA對應(yīng)的DNA頸環(huán)結(jié)構(gòu),退火后連入慢病毒干擾質(zhì)粒載體
3. 慢病毒載體的包裝與濃縮純化
制備慢病毒穿梭質(zhì)粒及其輔助包裝原件載體質(zhì)粒,三種質(zhì)粒載體分別進(jìn)行高純度無內(nèi)毒素抽提,共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后6 h 更換為*培養(yǎng)基,培養(yǎng)24和48h后,分別收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液,病毒上清液通過超離心濃縮病毒。
(二) 實(shí)驗(yàn)材料
2.1慢病毒載體、包裝細(xì)胞和菌株
該病毒包裝系統(tǒng)為三質(zhì)粒系統(tǒng),組成為pspax2, pMD2G, pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2。其中質(zhì)粒上的ZsGreen1表達(dá)框能表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)。
慢病毒載體構(gòu)建包裝實(shí)驗(yàn)流程如下:
1. 根據(jù)目的基因相關(guān)信息(序列,序列號(hào)等),構(gòu)建含有外源基因或siRNA的重組載體;
2. 對于測序正確的重組質(zhì)粒,提取和純化高質(zhì)量的不含內(nèi)毒素的重組質(zhì)粒;
3. 使用重組載體和病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞,進(jìn)行病毒包裝和生產(chǎn),收集病毒液;
4. 濃縮、純化病毒液;
5. 用高質(zhì)量的病毒液感染細(xì)胞;
6. 通過定量PCR測定病毒滴度(高滴定方法)和Western 分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果;
7. 用高質(zhì)量的病毒液感染宿主細(xì)胞;檢測基因功能或者siRNA的沉默效率以及使用藥物進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選,通常狀況下,篩選的細(xì)胞克隆株具有長期的表達(dá)穩(wěn)定性。病毒液足夠用于一般的動(dòng)物活體實(shí)驗(yàn)。

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