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基于慢病毒載體的miRNA載體構建技術服務|實驗技術服務

來源:上海乾思生物科技有限公司   2015年08月01日 15:21  

關鍵詞:基于慢病毒載體的miRNA載體構建技術服務|實驗技術服務
簡介:世界*品牌基于慢病毒載體的miRNA載體構建技術服務|實驗技術服務原裝,質量保證,*。
基于慢病毒載體的miRNA載體構建技術服務|實驗技術服務——pCzn1質粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
我們具備豐富的蛋白表達設計經驗及實驗操作技巧,承諾客戶不成功不收費。我們所有的實驗數據真實可信,我們提供原始的表達菌株和克隆質粒,客戶可以依據我們的實驗報告重復我們的實驗結果。
產品品牌:   http://www.。。com/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html    
測序實驗流程:
慢病毒載體包含了包裝、轉染、穩定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質粒可提供所有的轉錄并包裝RNA 到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產生高滴度的病毒顆粒,需要利用表達載體和包裝質粒同時共轉染細胞,在細胞中進行病毒的包裝,包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養基中,離心取得上清液后,可以直接用于宿主細胞的感染,目的基因進入到宿主細胞之后,經過反轉錄,整合到基因組,從而高水平的表達效應分子。
miRNA是一種21-25nt長的單鏈小分子RNA, 是由具有發夾結構的約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體經過Dicer酶加工后生成,miRNA具有高度的保守性、時序性和組織特異性.而且這種特異性和時序性,決定了組織和細胞的功能特異性,表明miRNA在細胞生長和發育過程的調節過程中起多種作用,因此miRNA的研究受到了生物學家的廣泛關注。 
本中心可以將客戶研究的miRNA構建到慢病毒載體,生產的病毒顆粒可以直接用于感染細胞或者動物實驗。可以選擇將Pri-miRNA或者PremiRNA構建到載體,構建中也可以根據實驗需要選用不同的Flank.
特點:
1.可以穩定長期的表達miRNA,可以用于篩選穩定細胞模型用于長期的研究和觀察。 
2.感染效率高而且可以感染絕大部分細胞種類。 
3.可以直接用于動物實驗或者感染細胞后回輸到動物體內。
1.將actin基因,放入慢病毒融合表達載體,與熒光蛋白(GFP)融合表達,注意避免移碼突變。
2.然后將重組質粒以及輔助質粒共轉染細胞,可以用脂質體法,慢病毒配套細胞一般為293。
3.收集慢病毒,濃縮。
4.用慢病毒轉染原代細胞。做好先做預實驗。
5.重組蛋白(例如,GFP-actin)在細胞內表達后,自然的混入細胞骨架中,將之標記綠色熒光。
(一) 實驗流程(1和2為并列步驟)
1.慢病毒過表達質粒載體的構建
設計上下游特異性擴增引物,同時引入酶切位點,PCR(采用高保真KOD酶,3K內突變率為0%)從模板中(CDNA質粒或者文庫)調取目的基因CDS區(coding sequence)連入T載體。將CDS區從T載體上切下,裝入慢病毒過表達質粒載體。
2.慢病毒干擾質粒載體的構建
合成siRNA對應的DNA頸環結構,退火后連入慢病毒干擾質粒載體
3. 慢病毒載體的包裝與濃縮純化
制備慢病毒穿梭質粒及其輔助包裝原件載體質粒,三種質粒載體分別進行高純度無內毒素抽提,共轉染293T細胞,轉染后6 h 更換為*培養基,培養24和48h后,分別收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液,病毒上清液通過超離心濃縮病毒。
(二) 實驗材料
2.1慢病毒載體、包裝細胞和菌株
該病毒包裝系統為三質粒系統,組成為pspax2, pMD2G, pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2。其中質粒上的ZsGreen1表達框能表達綠色熒光蛋白(GFP)。
存在問題
首先,重組病毒的滴度還不夠高,除Naldini等報道的結果外,其余均在101TU/ml~103TU/ml之間,難以達到體內應用的需要;
其次,由于HIV復雜的生物學性質,要像常用的小鼠逆轉錄病毒載體那樣建立穩定的HIV載體包裝細胞十分困難,已建立的包裝細胞均不理想。
更為謹慎的做法是,以非人類的慢病毒為基礎構建載體,如猴免疫缺損病毒(SIV)、貓和牛免疫缺損病毒(FIV和BIV)、馬傳染性貧血病病毒等,而這些工作尚屬空白。

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