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基因組文庫(Genomic Library)構建技術服務

來源:上海乾思生物科技有限公司   2015年08月01日 15:20  

關鍵詞:基因組文庫(Genomic Library)構建技術服務|實驗技術服務
簡介:世界*品牌基因組文庫(Genomic Library)構建技術服務|實驗技術服務原裝,質量保證,*。
基因組文庫(Genomic Library)構建技術服務|實驗技術服務——pCzn1質粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
我們具備豐富的蛋白表達設計經驗及實驗操作技巧,承諾客戶不成功不收費。我們所有的實驗數據真實可信,我們提供原始的表達菌株和克隆質粒,客戶可以依據我們的實驗報告重復我們的實驗結果。
產品品牌:基因組文庫(Genomic Library)構建技術服務|實驗技術服務   http://www.。。com/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html    
測序實驗流程:
基因組DNA文庫包括了基因組所有順序的隨機克隆片段。一個好的基因組DNA文庫的大小應足夠大,以便包括所有的基因DNA順序。DNA克隆片段也應足夠大,其中包括整個基因、連接基因及它們穩定形式所要的側翼順序。為了獲得高的克隆效率和較大的插入片段,λ噬菌體載體和質粒經常被使用構建基因組DNA文庫。λ噬菌體文庫易于操作,噬菌體載體上有多克隆位點。λ噬菌體能容納10-50kb插入DNA,載體類型應根據所要基因組DNA的大小和用途來選擇。
構建一個基因組DNA文庫的基本步驟:
①分離純化基因組DNA;
②切割DNA成合適大小的片段以用于克隆;
③載體DNA的制備;
④把基因組DNA段和載DNA連接;
⑤包裝重組分子;
⑥測定入噬菌體滴度;
⑦擴增DNA文庫;
⑧評估文的質量。
基因組文庫構建步驟:1、載體: 
l噬菌體:48.5kb,插入型(zui多可容納9kb)、取代型(可容納 38-51kb,zui適19-20kb), EMBL, Charon 粘性質粒(Cosmid):4-6kb, 質粒+噬菌體的性質,可容納大片段的外源基因,zui多可容納46kb。 酵母人工染色體克隆體系(YAC,Yeast Artificial Chromosome  Cloning System) 插入大小200—1000kb 2、 載體DNA的制備: 高分子量的外源DNA 100-150kb載體DNA酶切反應-----載體臂的純化-----載體脫磷處理 www.cqwestern。。com(常用BamHI)   (蔗糖密度梯度離心)  (堿性磷酸酶) 3、連接和包裝:外源片段與兩臂之間的比例,包裝蛋白 4、感染宿主菌:選擇合適的宿主菌,LE392, NM538, NM539, KW251等 5、基因組文庫的保存和擴增: 6、測滴度,要在106fu以上
7、保存:氯仿4℃,7% DMSO -70℃
需要注意:
(1)電泳時,要選用合適的DNA Ladder,以保證電泳后可以準確定位所需分子量的DNA。
(2)電泳以后,應盡量縮短用紫外光照射目標DNA的時間,否則會顯著降低克隆效率。
(3)回收DNA的時候,應該要避免過度離心,以防止DNA被剪切,降低文庫質量。
方法
1。將50μl BAC轉化菌的培養物接種到500ml含12。5μg/ml氯霉素的LB液體培養基中,37℃ 震蕩(280rpm)培養12到16小時。
2。2500g,4℃,離心15min,收集菌體。
3。用100ml冰預冷的STE重新懸浮細菌沉淀。按步驟2方法離心收集細菌。
4。用24ml含RNase(100μg/ml)的堿性裂解液I溶解細菌。加溶菌酶至終濃度為1mg/ml。
5。加入24ml新鮮配置的堿性裂解液II。蓋緊離心瓶蓋,輕輕翻轉瓶子數次,使內容物*混勻,冰裕5min。
6。加入24ml冰預冷的堿性裂解液III,蓋緊瓶蓋,輕輕翻轉瓶子數次,使內容物*混勻,置冰上5min。
7。15000g,4℃,離心10min,將上清轉移到另一離心瓶中,棄沉淀。
8。加等體積的酚:氯仿。輕輕翻轉離心瓶數次,混勻。3000g,室溫離心15min。
9。將水相移至另一離心瓶中,加入等體積的異丙醇,翻轉離心瓶數次,混勻。
10。15,000g,室溫離心15分鐘,回收核酸沉淀。
11。棄上清,用20ml 70%乙醇漂洗沉淀。
12。棄乙醇,風干使乙醇揮發殆盡。
13。小心將BAC DNA沉淀溶于0。2ml TE (pH8。0) 中。

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