通過CRISPR/Cas9基因組編輯系統的組成型過量表達而產生的擬南芥突變體，通常在T1代是嵌合體。七月二十一日，來自中國農業大學的研究人員在生物學期刊《Genome Biology》發表的一項研究中，利用卵細胞特異性的啟動子，來驅動Cas9的表達，并以很高的效率獲得了多個靶基因的非嵌合性T1突變體。延伸閱讀：用CRISPR編輯樹木基因組。
本文通訊作者是中國農業大學植物生理學與生物化學國家重點實驗室的陳其軍博士，其2002年在中國農業大學獲博士學位，2004年9月起在中國農業大學生物學院從事教學及科研工作，主要研究方向為：植物非生物逆境脅迫反應重要基因挖掘及功能鑒定；多基因轉化技術平臺的建立及其在抗逆基因工程中的應用研究；Ta-siRNAs的生物合成調控及在抗逆基因挖掘中的應用研究。
大量擬南芥序列索引的T-DNA插入突變體，對于直接研究基因功能，發揮了關鍵的作用。然而，有兩大障礙限制了這些全基因組表型篩選的應用。首先，大部分株系是半合子的，因此需要一個額外的步驟來確定純合植株，用于表型分析。第二，12%的基因沒有T-DNA插入突變體可用，8%的基因只由一個單一的等位基因代表。此外，剖析具有冗余功能的基因家族成員所扮演的角色，以及分析遺傳途徑中的上位性，經常需要攜帶多個基因突變的植物。
利用T-DNA插入誘變產生多基因突變的一個障礙是，這種方法需要費時費力的單突變體植株遺傳雜交。序列特異性核酸酶的進展，包括大范圍核酸酶、鋅指核酸酶（ZFNs）、轉錄激活因子樣效應物核酸酶（TALENs），和zui近的CRISPR/cas9系統，為開發快速、劃算的方法來產生新的突變植物群體和多基因突變植株，鋪平了道路。
CRISPR/cas9系統使用一種單向導RNA（sgRNA）提供序列特異性，并依賴sgRNA/Cas9復合物的核酸內切酶活性，在基因組特定位點產生雙鏈斷裂；這些雙鏈斷裂可導致宿主細胞中DNA修復系統的激活，通常是通過非同源末端連接途徑。由于修復途徑是容易出錯的，因此在修復過程中將會引入小的缺失或插入，從而產生突變。這種、易于使用的系統，可以用來產生多路復用的基因組修飾，并取代ZFNs和TALENs，成為標準的基因組編輯技術。
在脊椎動物中，將體外轉錄的Cas9 mRNA和sgRNA共注射到單細胞胚胎中，可地產生多基因的雙等位基因突變動物；多基因突變也可以有效地傳遞給下一代。然而，在植物中，細胞壁的存在使得RNA注射方法不切實際。制備可表達CRISPR/Cas9系統的轉基因株系，提供了一種替代方法。
用來制備轉基因株系的農桿菌介導的技術包括：植物原位轉化和胚性愈傷組織轉化。植物原位轉化zui典型的例子是農桿菌介導的擬南芥轉化，其卵細胞是T-DNA的靶標。胚性細胞來源的轉基因株系（表達CRISPR/Cas9系統），編輯的靶基因在*代植株中是純合的，說明在*次細胞分裂之前，靶基因就在轉化的胚性細胞中被編輯。番茄和玉米中也報道過類似的結果。這些結果對于作物基因組編輯的發展來說，是令人鼓舞的，因為作物轉化通常采用胚性愈傷組織細胞，它們可以被認為類似于單細胞階段的動物胚胎。
擬南芥非常適合于原位轉化，CRISPR/Cas9系統理論上應該在單細胞階段的胚胎中發揮作用。然而，表達CRISPR/Cas9的轉基因株系，在*代（T1）主要是嵌合體，從而表明擬南芥中CRISPR/Cas9誘導的突變發生在*個胚胎細胞分裂之后。也許CRISPR/Cas9不能在單細胞階段的胚胎中發揮功能，是由于組成型花椰菜花葉病毒35S啟動子（CaMV 35S）在卵細胞和單細胞階段胚胎中的活性較弱。
在這項研究中，研究人員使用卵細胞特異性EC1.2基因的啟動子，來驅動Cas9在擬南芥中的表達，表明CRISPR/Cas9在卵細胞和單細胞階段胚胎中的特異性表達，可有效地使T1代擬南芥產生多個靶基因的純合子或雙等位基因突變體。要識別*突變的、非嵌合性的株系，通常需要對從25-50個T1轉基因植株中篩選的一些候選株系，進行靶位點的中度測序（通過限制性內切酶分析、T7E1試驗或Surveyor檢測）。

然而，目前這種策略可以縮短所需的時間，在一個世代中產生這樣的突變體，從而提供一種更快、更具成本效益的方法，來制備新的擬南芥突變群體和多基因突變體。根據對啟動子和終止子的不同組合進行比較，研究人員還提出了一種方法，來優化卵細胞特異性啟動子控制的（EPC）CRISPR/Cas9系統。