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第八章 抗體孵育

來源:上?;偕锟萍加邢薰?nbsp;  2015年07月14日 09:39  

                                   第八章 抗體孵育


一抗孵育(Primary antibody incubation)

參考一抗的說明書,按照適當比例用封閉液稀釋一抗。吸盡封閉液后,立即加入稀釋好的一抗,室溫或 4℃在搖床上緩慢搖動孵育 12 小時。如果一抗孵育一小時效果不佳,可以在 4℃緩慢搖動孵育一夜。(注意:抗體濃度過高會導致背景較深,過低會導致和抗原結合不充分,出現假陰性 )。回收一抗。然后加入 Western 洗滌液,在搖床上緩慢搖動洗滌 5-10 分鐘。吸盡洗滌液后,再加入洗滌液,洗滌 5-10 分鐘。共洗滌 3 次。如果結果背景較高可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數。

 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)

參考二抗的說明書,按照適當比例用封閉液稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗。吸盡洗滌液后,立即加入稀釋好的二抗,室溫或 4℃在搖床上緩慢搖動孵育 12 小時?;厥斩?。然后加入 Western 洗滌液,在搖床上緩慢搖動洗滌 5-10 分鐘。吸盡洗滌液后,再加入洗滌液,洗滌 5-10 分鐘。共洗滌 3 次。如果結果背景較高可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數。 2 步洗滌是為了洗去一抗和二抗的非特異性結合,洗滌的效果直接影響結果背景的深淺,所以洗滌一定要干凈。洗滌液使用 TBST 或者 PBST,其中的 Tween20 有助于去除非特異性的結合,減少背景。同時短時間多次的洗膜(如 5-6 次,每次 3 分鐘)比長時間少次數的洗膜更有效。 3  TBS 洗滌是為了洗去膜上的 Tween-20,因為它可以阻礙底物的沉積。

  注意事項

1. 抗體保存注意事項:

收到抗體后按要求離心后再打開管蓋進行分裝和保存!

對于大部分抗體,比較合適的保存方式是分裝后保存在-20 。

分裝的量以一次實驗用完為好,zui少不能少于 10 ul 每份。因為分裝體積越小,抗體的濃度越可能會受到蒸發以及管壁吸附的影響。復融后的分裝抗體如果一次用不完,將剩余母液保存在 40℃,避免再凍起來!

避免將抗體保存在自動除霜冰箱中。

大部分抗體收到后 40℃短暫保存 1-2 周對抗體活性是沒有影響的。長期保存,加入疊氮納,防止細菌污染。

2. 一抗/二抗使用問題:

   一抗、二抗的濃度一般要參照抗體說明書選擇zui適當的比例,一抗二抗的選擇直接影響實驗結果以及背景的深淺。要嚴格保證反應時間,洗膜要注意盡可能地將一抗二抗洗凈,有利于降低背景;還要注意一抗二抗的匹配。

3. 天然和非還原樣品問題:

   有些抗體只能識別的表位是非連續氨基酸,這些氨基酸雖然在蛋白質一級結構中彼此不連續,但是在空間結構中則是靠在一起的。這些抗體就只能識別靶蛋白的空間結構狀態(抗體說明書中會有特殊說明)。對于這些樣品,緩沖液和凝膠中就不能含有 SDS,并且不能夠對蛋白進行加熱變性。有些抗體只能識別蛋白的非還原狀態如氧化狀態,對此類樣品,就需要將緩沖液和凝膠中的還原劑 DTT beta-巰基乙醇去除。

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