固相萃取

1. SPE 技術的原理類型及操作方法

SPE又稱之為固液萃取(Solid Liquid Extraction, SLE) 是一個包括液相和固相的物理萃取過程,萃取過程中固相對分析物的吸附力大于樣品基液,當樣品通過固相柱時分析物吸附在固體填料表面,其它樣品組分則通過柱子分析物可用適當溶劑洗脫下來,從而達到分離和凈化的目的,根據S P E 柱中填料的不同S P E 有3 種類型,即反相萃取,正相萃取和離子交換萃取. 正相SPE 所用的吸附劑都是極性的如鍵合硅膠,氧化鋁,硅鎂吸, 弗羅里硅土(2MgO·3SiO2)附劑等;用來萃取極性物質;反相SPE,所用的吸附劑通常是非極性的或是弱極性的如C8,C18,苯基柱等,所萃取的目標化合物通常是中等極性到非極性的;化合物離子交換型SPE 所用的吸附劑是帶電荷的離子交換樹脂如LC-NH2( 含脂肪族季氨丙基鍵合硅膠), LC-SCX(含脂肪族磺酸基鍵合硅膠),等所萃取的目標化合物是帶電荷的化合物.

根據分析物的性質和分離要求可選擇不同的萃取模式包括樣品凈化樣品濃縮和除去樣品基液不同類型的萃取S P E 操作方法略有不同對于反相萃取而言基本程序一般包括:S P E 柱的活化,樣品添加SPE 柱,洗滌和干燥,分析物的洗脫等幾個步驟.一般先用極性有機溶劑對固相柱進行活化,再用水或適當的緩沖液沖洗小柱,轉移過多的甲醇,以便樣本與固相表面發生作用,然后將經適當處理的樣品液添加于固相柱中,用正壓或負壓使樣品保持一定的流速通過柱子,再用適當的洗滌劑選擇性地洗去雜質而分析物保留在柱子上,zui后固相柱經干燥后選取合適的洗脫劑選擇性地將分析物洗脫下來.

 以上詳述了化合物在固相萃取方法中是如何保留的基本原理。對鍵合硅膠可能有二級相互作用的存在。

對反相鍵合硅膠，基本原理是非極性的相互作用。然而，由于硅膠只是主體，有一少部分硅甲醇存在，這就有一些極性二級相互作用（正如我們在正相固相萃取取所談）將要發生。如果非極性溶劑不能有效地從反相固相萃取填料上洗脫化合物，就有必要加些極性溶劑（如甲醇），以破壞極性相互作用而保留的化合物。在這種情況下，甲醇與硅膠上的羥基形成氫鍵，打斷了分析物與硅膠上的羥基形成的氫鍵。

硅甲醇在硅膠表面，Si-OH，也可為酸性，當pH大于4時，以Si-O^-型式存在。這時在硅膠基體上也可能發生陽離子交換的二級相互作用，能吸附陽離子或堿性分析物。在這些情況，調整洗脫溶液的pH非常重要，以破壞這些相互作用而洗脫分析物（酸中和硅甲醇或堿中和分析物）。可選用含有酸的甲醇（98%甲醇、2%濃鹽酸）或者含有堿的甲醇（98%甲醇、2%濃氫氧化氨），或者用一種熔于甲醇的非極性有機溶劑來洗脫。

正相鍵合硅膠通過其鍵合基團展示了極性保留機理，但是也有一些二級相互作用發生在分析物與聯接鍵合基團的烷基鏈之間。在這種情況下，更非極性的溶劑或極性—非極性混和溶劑可用來做洗脫溶劑。作為反相鍵合硅膠，硅膠基體與分析物之間的二級相互作用和陽離子交換作用也可能發生。

離子交換鍵合硅膠不僅能提供這種分析物與硅膠上部分非極性基團之間的非極性二級相互作用，而且還有分析物與硅膠基體之間的極性和陽離子交換作用。要從這些填料上洗脫分分析物，一個準確的pH、離子強度和有機物的含量是必要的。

固相萃取中的PH影響

用在固相萃取中的溶液有很大pH范圍的溶液有。硅膠作為基體原料，如高壓液相色譜柱，通常穩定的pH范圍是2-7.5。當pH高于和低于這個范圍，鍵合相就會水解和從硅膠上斷鏈下來，或者硅膠本身就溶解了。然而，在固相萃取中，常常溶液只與吸附劑接觸較短的時間。實際上固相萃取管都是一次性使用，允許任何pH溶液以達到*保留和洗脫效果。如果固相萃取管對pH極限的穩定性非常重要時，聚合或碳鍵合固相萃取材料均可選用，如ENVI-Chrom P或ENVI-Carb。這些材料在1-14pH范圍內都是穩定的。

對于鍵合硅膠上反相固相萃取過程，如果希望保留分析物，預處理的溶液和樣品（基本上或全部為水溶液）的pH應調至zui適宜分析物保留。如果，分析物是酸或堿性的，通常情況下，使用的pH應該阻止化合物帶電荷。中性化合物（無酸性和堿性基團）的保留，一般不受pH影響。相反，也能調節pH，使樣品中不需要的化合物保留在固相萃取的填料上，而分析物則不被保留而流出。在適當的pH，分析物的再次親水性和陽離子交換作用則能被利用。

吸附劑(如ENVI-Chrom P和ENVI-Carb)用于反相條件，則應選擇pH，使分析物zui大程度地保留在反相硅膠上。一般使用有機溶劑洗脫時，這一點上的pH無足輕重。令人吃驚的是，當溶液在中性pH條件下，苯酚可帶電荷，它能更好的保留在ENVI-Chrom P上，而不是溶液在酸性pH，苯酚不帶電荷的情況。這表明，相對鍵合硅膠吸附劑對某些化合物有不同的選擇性。當使用這類填料時，應對樣品和預處理溶液的pH范圍有所研究。

對于鍵合硅膠或吸附劑上的正相固相萃取過程，pH一般是無關重要的。因為在這些過程中所用的溶劑一般為非極性有機溶劑，而不是水。

離子交換固相萃取是如何保留化合物，很大程度上取決于樣品和預處理溶液的pH。為了保留化合物，樣品的pH應保證分析物和硅膠表面的官能團帶上相反的電荷。

SPE 填料類型

SPE 萃取原理

化合物是怎樣被吸附而保留在 SPE 填料上的？

1. 反相SPE

反相分離包括一個極性（通常是水溶液，見第11 頁表A）或中等極性的樣品基質（流動相）和一個非極性的固定相。所感興趣的分析物通常是中等極性到非極性。幾種SPE 填料，例如烷基或芳香基鍵合的硅膠（C18，C8，C4 和Phenyl 等）屬于反相類型。這里，純硅膠（一般孔徑為60?，粒徑約45μm 的顆粒）表面的親水性硅醇基通過硅烷化反應，鍵合上疏水性的烷基或芳香基。

    由于分析物中的碳氫鍵同硅膠表面官能團的吸附作用，使得極性溶液（例如：水）中的有機分析物能保留在SPE 填料上。這些非極性-非極性吸附力通常稱為范德華力或色散力。為了從反相SPE 小柱或膜片上洗脫被吸附的化合物，一般采用非極性溶劑去破壞這種化合物被填料吸附的作用。所有的硅膠鍵合相都有一定數量未反應的硅醇基，使其導致了次級相互作用。在萃取或保留強極性分析物或污染物時，這種次級相互作用是非常有用的，但是對分析物的吸附也可能是不可逆的。

    Carbon（石墨化碳黑）、MEP（共聚物類型）和PS/DVB（聚合物）也用于反相條件。

含碳的吸附填料，如Carbon，是由石墨化無孔碳組成，它對極性和非極性基質中的極性和非極性有機化合物均有較高的吸附能力。這種碳表面是由正六元環的原子構成，碳原子相互連接成為石墨層。這種正六元環結構顯示了對某些分子有很強的選擇性，比如平面型芳香化合物或類正六元環分子和可形成許多表面接觸點的烴鏈分子。分析物的保留取決于其結構（形狀和大小），而不是官能團與填料表面的相互作用，洗脫液采用中等極性到非極性溶劑。與烷基化硅膠相比，尤其使用烷基化硅膠達不到保留的目的時，Carbon 石墨化碳黑*的結構和選擇性便發揮出它的優勢。

MEP 的填料為乙烯吡咯烷酮和苯乙烯-二乙烯苯共聚而得，由于極性吡咯烷酮的引入，使得MEP 對極性和非極性化合物都具有均衡吸附性以及高比表面積。因此，這類共聚物類型的SPE 應用極為廣泛，尤其適用于在C18 柱上難以得到保留的強親水性化合物，如多氯苯酚，磷酸酯，藥物代謝物等，具有很高的回收率；此外，由于吡咯烷酮的親水性，使得SPE 小柱更容易被潤濕，保證了結果的重現性。

PS/DVB 是單純的苯乙烯-二乙烯基苯聚合物，同樣可用于反相條件，保留一些含有親水性官能團的疏水性化合物，尤其是芳香族化合物。在反相條件下，苯酚有時很難保留在C18 填料上，這主要是因為它在水中的溶解度大于有機相。PS/DVB 顯示出它能在反相條件下很好的保留苯酚類化合物，洗脫液可以選擇中等極性到非極性溶劑，因為聚合類填料對所有的溶劑幾乎都是很穩定的。

2. 正相SPE

正相固相萃取過程包括一個極性分析物，中等極性到非極性的樣品基質（如丙酮，鹵化溶劑和正己烷）以及一個極性固定相。極性官能團鍵合的硅膠（如CN，NH2，和Diol）和極性吸附填料（如Si，Florisil，和Alumina）常用于正相條件。在正相條件下，分析物的保留取決于分析物的極性官能團與吸附劑表面極性官能團之間的相互作用，包括氫鍵，π-π相互作用，偶極-偶極相互作用和偶極-誘導偶極相互作用及其它。因此，在正相條件下被吸附的分析物，洗脫溶劑選用比樣品極性更大的溶劑去破壞其相互作用。

鍵合相硅膠如 CN，NH2 和Diol，是帶有極性官能團的短烷基鏈鍵合在硅膠表面上。由于極性官能團的存在，這類填料相對于反相硅膠具有親水性。典型的正相硅膠，常用于從非極性體系中吸附極性化合物。這類固相萃取小柱已廣泛用于吸附和選擇性洗脫結構類似的化合物（如異構體）、復雜的混合物或者藥物和脂類化合物。同時，它也可用于反相條件（水溶液樣品），以利用其烷基短鏈的疏水性。

Si 填料是沒有衍生化的硅膠，通常作為所有硅膠鍵合相的基體，這種硅膠親水性*，必須保持干燥，所用的樣品則需相對無水。從非極性物質中吸附化合物的作用官能團是硅膠顆粒表面的自由羥基，Si 填料可用于從非極性體系中吸附極性化合物，然后用一種比樣品體系的極性更強的有機溶劑洗脫。但是在多數情況下，Si 是作為一種吸附劑，用于有機物萃取時，分析物不被硅膠吸附而直接流出小柱，不需要的化合物則被吸附在硅膠上而丟棄，此過程通常被稱作樣品的純化。

Florisil SPE 的填料是硅酸鎂，通常用于有機物的樣品純化，這種強極性填料可以有效地從非極性體系中吸附極性化合物。我們有一種Florisil SPE 小柱的濾片是特氟隆或不銹鋼材質，這種在美國環境保護組織（US EPA）的方法中描述是環境樣品萃取過程中必要的構造，這種Florisil 小柱尤其在氣相色譜分析中干擾背景非常低。

Alumina SPE 也被作為吸附或樣品純化的類型，氧化鋁填料可分為酸性（Alumina-A，pH～4.5），堿性（Alumina-B，pH～10），或中性（Alumina-N，pH～7.5），此類屬于Brockmann Ⅰ級活性度。在氧化鋁填裝前或填裝后通過控制加入的水分量，可使其活性度從Ⅰ級到Ⅳ級變化。

3. 離子交換SPE

離子交換固相萃取適用于在溶液中帶電荷的化合物（通常為水溶液，有時也為有機溶液）。陰離子（負電荷）化合物可用SAX 或NH2 小柱分離；陽離子（正電荷）化合物可用SCX 或WCX 小柱分離。基本作用原理是靜電吸引，即化合物上的帶電基團與硅膠鍵合相的帶電基團之間的靜電吸引。通過離子交換從水溶液中保留化合物，樣品體系的pH 值必須保證使其分析物的官能團和硅膠鍵合相的官能團均帶電荷。如果某種雜質帶有與分析物一樣的電荷，它將會干擾分析物的吸附，當然這種情況是很少的。一定pH 值的洗脫溶液用于中和分析物官能團上所帶電荷，或者中和硅膠鍵合相官能團所帶電荷，當其中一方官能團上的電荷被中和，靜電吸引也就被破壞了，分析物隨之洗脫。此外，洗脫溶液含有較高離子強度或者含有一種能取代被吸附化合物的離子，同樣可以洗脫分析物。

陰離子交換

    SAX 填料是硅膠表面鍵合了脂肪族季銨基團，季銨基團是一種很強的堿，表現為一個正電荷的陽離子，能交換或吸附溶液中的陰離子，因此被稱之為強陰離子交換劑（SAX）。季銨基團的pKa 值很高（＞14），在水溶液中任何pH 條件下都能使硅膠鍵合相帶上電荷，所以，SAX 用于分離強陰離子化合物（很低的pKa，＜l）或弱陰離子化合物（中等低pKa，＞2），只要在樣品體系的pH 條件下，分析物帶有電荷。對于陰離子分析物（酸性），樣品體系的pH 值必須比分析物的pKa 大2 個單位，使其帶上電荷，大多數情況下，被分析物是強酸性或者弱酸性的。

由于 SAX 的強度很高，只有在不要求陰離子的回收或者洗脫的情況下（化合物被分離后丟棄），才能用SAX 萃取強陰離子。弱陰離子可以被SAX 分離并洗脫，因為它們能被另一種陰離子所取代或者被酸性溶液洗脫，該酸性溶液的pH 可中和被吸附的陰離子（pH 比其pKa 小2 個單位）。如果需要回收強陰離子化合物時，請選擇NH2。

用于正相分離的 NH2 固相萃取填料在用于水溶液時，也做為一種弱陰離子交換劑（WAX）。NH2 填料是一種硅膠表面鍵合了脂肪族氨丙基。這種伯胺基團的pKa 大約為9.8。要作為陰離子交換劑，樣品的pH 必須小于9.8 至少2 個單位，此pH 同時須保證所分析的陰離子化合物帶上電荷（比其pKa 大2 個單位）。NH2 可用于強陰離子和弱陰離子的分離回收，這是因為硅膠表面的氨基可以被中和（比其pKa 大2個單位）以洗脫強陰離子或弱陰離子。弱陰離子除了用中和吸附離子的溶液（pH 低于pKa 2 個單位）洗脫外，也可以加入另一種陰離子取代分析物。

陽離子交換

    SCX 填料含有一個脂肪族磺酸基鍵合在硅膠表面上，磺酸基有很強的酸性（pKa＜1），它能吸附或者交換接觸溶液的陽離子——因此稱之為強陽離子交換（SCX）。在所有的pH 下，這種官能團都能帶上電荷，只要樣品溶液pH 值能保證目標物帶有電荷，SCX 就能用于分離強陽離子（pKa＞14）或弱陽離子（pKa＜12）化合物。對于所分析的陽離子（堿性）化合物，溶液的pH 要比目標物pKa 小2 個單位，以保證其帶電荷。多數情況下，所分析的化合物是強堿性的或弱堿性的。

當不要求強陽離子回收或者洗脫時，SCX 固相萃取小柱可用于強陽離子的分離；弱陽離子則可以用SCX 分離和洗脫。洗脫時，用一種pH 比目標物pKa 大2 個單位的溶液（中和分析物），或者加入另外一種陽離子取而代之。如果要求強陽離子的回收，選用WCX。

WCX 固相萃取填料含有一個脂肪族羧酸基團鍵合在硅膠表面上，羧基是一種弱陰離子，所以它作為一種弱陽離子交換（WCX）。WCX 上羧基的pKa 約4.8，當溶液pH 比其pKa 大2 個單位時，它保持帶負電荷，能分離此pH 下帶電荷的陽離子。WCX 可用于強或弱陽離子分離和回收，因為硅膠表面的羧基能被中和（pH 比其pKa 小2 個單位），強或弱陽離子則被洗脫。弱陽離子可用一種溶液（pH 比陽離子pKa大2 個單位）中和而洗脫，或者加入另外一種陽離子取而代之。

在很多情況下，由離子交換固相萃取所吸附的分析物被洗脫在水溶液中。如果您必須使用酸性或堿性溶液去洗脫固相萃取小柱上的分析物，但分析物又必須在有機溶劑中分析而有機溶劑與水不混溶，這種情況下，您可用含有酸的甲醇（98％甲醇／2％濃鹽酸）或者含有堿的甲醇（98％甲醇／2％氫氧化胺）來洗脫。甲醇很容易揮發，樣品可再溶解在另一種溶劑里。如果您需要一個很強（非極性）的溶劑從固相萃取填料上洗脫分析物，可加入二氯甲烷、正已烷或乙酸乙脂到酸性或堿性的甲醇里。

4. 次級相互作用

以上詳述了化合物在固相萃取填料上初級保留的基本原理。對于鍵合相硅膠，可能有次級相互作用的存在。

反相鍵合硅膠，基本原理是非極性相互作用。但是，由于硅膠顆粒的基體，可能發生少部分殘留硅羥基導致的極性次級相互作用（正如我們在正相固相萃取中所談及）。如果非極性溶劑不能有效地從反相固相萃取填料上洗脫化合物，可以加一些極性溶劑（如甲醇），以破壞極性相互作用而保留的化合物。在這種情況下，甲醇與硅膠上的羥基形成氫鍵，打斷了分析物與硅膠上的羥基形成的氫鍵。

    硅膠表面的硅羥基，Si-OH，也可認為是酸性的，當pH 大于4 時，以Si-O 形式存在。這時在硅膠基體上也可能發生陽離子交換的次級相互作用，能吸附陽離子或堿性分析物。在這些情況下，調節洗脫溶液的pH 非常重要，以之破壞這些相互作用而洗脫分析物（酸中和硅羥基或堿中和堿性分析物），可選用含有酸的甲醇（98％甲醇2％濃鹽酸）或者含有堿的甲醇（98％甲醇2％氫氧化胺），或者用一種溶于甲醇的非極性有機溶劑混溶來洗脫。

正相鍵合硅膠通過其鍵合相基團顯示了極性保留機理，但是也存在分析物與支撐鍵合相基團的烷基鏈之間的次級相互作用。在這種情況下，更非極性的溶劑或極性-非極性混和溶劑可用來做洗脫溶劑。作為反相鍵合硅膠，硅膠基體與分析物之間的次級相互作用和陽離子交換作用也可能發生。

離子交換鍵合相硅膠能產生分析物與基團上非極性部分之間的非極性次級相互作用，還有分析物與硅膠基體之間的極性次級相互作用和陽離子交換作用。從這類填料上洗脫分析物，的pH 值、離子強度和有機物的含量很重要。

5. pH 值對SPE 的影響

用于固相萃取的溶液有很廣的 pH 范圍。硅膠作為基體，如高壓液相色譜柱，通常穩定的pH 范圍是2-7.5，當pH 高于或低于這個范圍，鍵合相就會水解并從硅膠上斷鏈下來，或者硅膠本身就溶解了。然而，在固相萃取中，溶液只與填料接觸較短的時間，而實際上固相萃取小柱都是一次性使用，可以允許任何pH溶液以達到*保留和洗脫效果。如果固相萃取小柱在一個極限pH 值的穩定性非常重要，聚合物類或石墨化碳黑類型的固相萃取填料可選用，如MEP、PS/DVB 或Carbon，這些填料在pH1-14 范圍內都是穩定的。

對于反相鍵合相的固相萃取過程，如果希望保留分析物，預處理的溶液和樣品（如果大部分或全部為水溶液）pH 應調節至zui適宜分析物保留的狀態。如果分析物是酸性或堿性的，通常情況下，您使用的pH應該阻止化合物帶電荷。中性化合物（無酸性和堿性基團）的保留，一般不受pH 影響。相反，您也能調節pH，使樣品中不需要的化合物保留在固相萃取的填料上，而分析物不被保留而流出。分析物的次級親水性和陽離子交換作用在適當的pH 下也能用于保留在填料上（詳見次級相互作用）。

    對于吸附類填料（如 MEP、PS/DVB 和Carbon）用于反相條件時，選擇zui大程度保留分析物的pH值如同在反相硅膠上，洗脫時通常用有機溶劑，所以此時pH 無足輕重。令人吃驚的是，當溶液在中性pH條件下，苯酚帶上電荷，但卻能更好地保留在PS/DVB 上，而不是酸性pH 的溶液中，苯酚不帶電荷的情況下。這就說明了相對鍵合相硅膠，吸附類填料對某些化合物有不同的選擇性。當您使用這類填料時，應對樣品和預處理溶液的pH 有所優化。

當鍵合相硅膠或吸附類填料用于正相固相萃取過程，pH 一般是無關緊要的。因為在這些過程中所用的溶劑通常為非極性有機溶劑，而不是水。

離子交換固相萃取是如何保留化合物，很大程度上取決于樣品和預處理溶液的pH。為了保留化合物，

樣品的pH 應保證分析物和硅膠表面的官能團帶上相反的電荷。