關(guān)鍵詞:ELISA即酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
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ELISA即酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
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測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體，②酶標(biāo)記的抗原或抗體，③酶作用的底物。根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的性狀以及檢測(cè)的具備條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法。
（一）間接法測(cè)抗體
1．酶標(biāo)抗抗體工作濃度的選擇
（1）用100ng/ml人IgG進(jìn)行包被，洗滌。
（2）將酶標(biāo)抗人IgG用稀釋液作一系列稀釋后分別加入已包被的孔中，保溫、洗滌。
（3）加底物顯色。加酸終止反應(yīng)后，讀取吸亮度（A），繪制曲線如圖15-10。讀取A值在1.0時(shí)的酶標(biāo)抗體稀釋度，作為酶標(biāo)抗體的工作濃度。該酶標(biāo)抗人IgG的工作濃度應(yīng)為1/1600。
2．棋盤滴定法選擇包被抗原工作濃度
（1）用包被液將抗原作一系列稀釋后進(jìn)行包被，洗滌。
（2）將強(qiáng)陽性參考血清、弱陽性參考血清和陰性參考血清用稀釋液作1:100稀釋，加樣，保溫，洗滌。
（3）加按工作濃度稀釋的酶標(biāo)抗人IgG抗體，保溫，洗滌。
（4）加底物顯色。加酸終止反應(yīng)后讀取A值。
夾心ELISA包被抗體和酶標(biāo)抗體工作濃度的選擇
（1）抗體免疫球蛋白用包被緩沖液稀釋至蛋白濃度為10、1和0.1μg/ml，分別在ELISA板上進(jìn)行包被，每一濃度包括三個(gè)縱行，洗滌。
（2）在一個(gè)橫行各包被孔中加入強(qiáng)陽性抗原液，另一橫行加入弱陽性抗原液，第三橫行加入陰性對(duì)照液，保溫，洗滌。
（3）將酶標(biāo)抗體用稀釋液稀釋成三個(gè)濃度，例如1:1000、1:5000和1:25000。分別加入每一包被濃度的一個(gè)縱行中，保溫，洗滌。
（4）加底物顯色。加酸終止反應(yīng)后，讀取A值。
（5）以強(qiáng)陽性抗原的A值在0.8左右、陰性參考的A值小于0.1的條件作zui適條件，據(jù)此選擇包被抗體和酶標(biāo)抗體的工作濃度。從表15-2可看出包被抗體濃度可選用1μg/ml，酶標(biāo)抗體的稀釋度可選為1:5000。為了進(jìn)一步節(jié)省試劑，可以此濃度為基點(diǎn)，縮小間距再做進(jìn)一步的棋盤滴定。
（5）選擇強(qiáng)陽性參考血清的A值為0.8左右、陰性參考血清的A值小于0.1的包被抗的的稀釋度作為工作濃度。
ELISA（酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定）的基本原理有三條：
1. 抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面間的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫學(xué)活性；
2. 抗原或抗體可通過共價(jià)鍵與酶連接形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性；
3. 酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后，可根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來判定是否有免疫反應(yīng)的存在，而且顏色反應(yīng)的深淺是與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體的量成正比例的，因此，可以按底物顯色的程度顯示試驗(yàn)結(jié)果。
注意事項(xiàng) :
正式實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)分別以陽性對(duì)照和陰性對(duì)照控制試驗(yàn)條件，待測(cè)樣品應(yīng)做一式二份，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時(shí)本底較高，說明有非特異性反應(yīng)，可采用羊血清，兔血清、BSA或OVA等封閉。