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內皮細胞培養技術服務|實驗技術服務

來源:上海拜力生物科技有限公司   2015年05月15日 12:36  

關鍵詞:內皮細胞培養技術服務|實驗技術服務
簡介:世界*品牌內皮細胞培養技術服務|實驗技術服務原裝,質量保證,*。
內皮細胞培養技術服務|實驗技術服務——pCzn1質粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
我們具備豐富的蛋白表達設計經驗及實驗操作技巧,承諾客戶不成功不收費。我們所有的實驗數據真實可信,我們提供原始的表達菌株和克隆質粒,客戶可以依據我們的實驗報告重復我們的實驗結果。
產品品牌:   http://www.。。com/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html    
測序實驗流程:
1.干粉培養基原倍液的配制
1)配制過濾除菌的細胞培養基
①閱讀培養基使用說明,確定需要添加何種添加劑(如NaHCO3、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等)。
②根據所需將培養基全部倒入一容器中,用少量注射用水(20℃~30℃)將袋內殘留培養基洗下整理并入容器。加注射用水至總體積的95%,輕微攪拌溶解。
③加入規定量的碳酸氫鈉及所要添加的物質。
④輕微攪拌溶解,加注射用水至規定體積。
⑤用1mol/L氫氧化鈉溶液或1mol/L鹽酸溶液調pH至所需值。
⑥用0.22μm濾膜正壓過濾除菌。
⑦溶液應在2℃~8℃下避光保存。
2.配制可高壓滅菌細胞培養基
①根據所需將培養基全部倒入一容器中,用少量注射用水(20℃~30℃)將袋內殘留培養基洗下,并入容器。加注射用水至總體積的95%,輕微攪拌溶解。
②在121℃、15psi下滅菌15分鐘。
③待溶液冷卻至室溫,加入無菌0.2mol/LL-谷氨酰胺溶液規定體積、無菌7.5%(w/v)碳酸氫鈉溶液規定體積,加注射用水(20℃~30℃)至規定體積,混勻。
④如果必要,用1mol/L氫氧化鈉溶液或1mol/L鹽酸溶液調pH至所需值。
⑤溶液應在2℃~8℃下避光保存。
內皮細胞易于從大血管分離培養成單層細胞,對于研究內皮細胞再生、腫瘤促血管生長因子(TAF)等有很大價值。
研究人內皮細胞培養以人臍帶靜脈灌流消化法zui為簡便,其法如下:
1、產后新鮮臍帶,無菌剪取10—15厘米長一段,如不能立即培養,可于12小時內保存于4℃。
2、用三通注射器吸取溫PBS液注入臍靜脈中洗去殘血,在入口處用線繩扎緊,以防液體返流。
3、用血管鉗夾緊臍帶一端,從另一端向臍靜脈中徐徐注入終濃度為0.1%的粗制膠原酶,充滿血管,消化3—10分鐘;注入口用線繩扎,以防液體返流。
4、吸出含有內皮細胞的消化液,于離心管中,注入溫PBS輕輕反復沖洗后,一并注入離心管中(此步驟可重復)。
5、離心去上清,加入RPMI1640培養液制成細胞懸液,接種入培養器皿中,置溫箱培養。兩至三天可見細胞長成單層。
腫瘤條件培養基制備:
1.取C3H小鼠的S-180實體肉瘤組織。
2.胰蛋白酶消化,Dulbecco改良Eagle氏培養液15ml(含10%小牛血清),接種到T-75 Falcon產培養瓶中培養。
3.在細胞生長接近*匯合時,收集培養液制成條件培養基;再用含10%小牛血清的新培養液后,也每隔兩天收集一次,可獲得多量條件培養基。
4.4000轉/分離心后,再通過0.22μm微孔濾膜濾過,-20℃凍存備用(臨用前融解)。
初代培養:
1.取材:取新鮮牛腎上腺數個,先用Hanks液洗除血污。
2.剝除被膜,分離出皮質,切成1立方毫米小塊,加0.5%膠原酶室溫中消化1小時,每隔10分鐘用吸管吹打懸液令消化充分。
3.通過不銹鋼紗網濾過,網眼要求只允許能通過小于110微米長的毛細血管小段。
4.650rpm,4℃,離心7分鐘后,棄掉上清膠原酶。
5.沉淀物用培養液重懸并離心,再重懸,再離心,共兩次。
6.末次沉淀物仍用含有10%小牛血清的Dulbecco改良Eagle氏培養液重懸后,稍吹打。
7.接種于鋪有明膠底層的培養皿中,37℃培養,在培養頭1~3小時中,毛細血管小段和內皮細胞zui先帖附于底物上,而腎上腺細胞和成纖維細胞卻仍在培養液中漂浮。
8.趁此時,吸除培養液,再加入腫瘤條件培養液,每兩天換液一次。毛細血管小段一般成自1~4個內皮細胞,以后每個小段在底物上慢慢展成特殊形態的細胞島,能持續2~5天。
毛細血管內皮細胞分離培養:
1.初代培養2~3天后,鏡下確認幾個毛細血管內皮細胞島,在培養皿背面,用不脫色筆劃圈圈起。
2.鏡下檢查,如圈內殘有非內皮細胞時,可用顯微細針在倒置顯微鏡下挑除。此操作用細胞解剖器或用手操作均可,宜在凈化臺無菌氣流中、打開培養皿蓋進行,但時間不宜過長(15~20分鐘),圈內非內皮細胞可用無菌膠刮除。
3.用培養液漂洗兩次,以去除漂浮細胞。
4.剩余內皮細胞島如小(5~20個細胞)而少時,生長增值變得緩慢或不*不生長,此時需加入3T3等飼細胞,飼細胞接種量為4000細胞/cm2。
5.當內皮細胞充滿所有飼細胞空間后,用胰蛋白酶消化、離心、加入腫瘤條件培養基。
6.接種入明膠底物皿中繼續培養(飼細胞死亡淘汰),細胞增殖生長匯合后,按1:5傳代。

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