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免疫共沉淀技術服務|實驗技術服務

來源:上海拜力生物科技有限公司   2015年05月15日 12:29  

關鍵詞:免疫共沉淀技術服務|實驗技術服務
簡介:世界*品牌免疫共沉淀技術服務|實驗技術服務原裝,質量保證,*。
免疫共沉淀技術服務|實驗技術服務——pCzn1質粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
我們具備豐富的蛋白表達設計經驗及實驗操作技巧,承諾客戶不成功不收費。我們所有的實驗數據真實可信,我們提供原始的表達菌株和克隆質粒,客戶可以依據我們的實驗報告重復我們的實驗結果。
產品品牌:   http://www.。。com/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html    
測序實驗流程:
工作液配制:
配制100ml的modified RIPA buffer:
   1) 稱取790mg 的Tris-Base,加到75ml 去離子水中,加入900mg的NaCl,攪拌,直到全部溶解,用HCl調節PH值到7.4
   2) 加10 ml 10%的NP-40
   3) 加2.5 ml 10%的去氧膽酸鈉,攪拌,直到溶液澄清
   4) 加1 ml 100mM的EDTA,用量筒定容到100ml,2-8℃保存
   5) 理論上,蛋白酶和磷酸酯酶抑制劑應該在使用當天同時加入(抑蛋白酶肽,亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制劑各100μl;PMSF,Na3VO4,NaF各500 μl),但是PMSF在水溶液中很不穩定,30分鐘就會降解一半,所以PMSF應該在使用前現加,其他抑制劑成分可以在水溶液中穩定5天。
各種成分在工作液中的終濃度:
* Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4
* NP-40: 1%
* 去氧膽酸鈉:0.25%
* NaCl: 150 mM
* EDTA: 1 mM
* PMSF: 1 mM
* 抑蛋白酶肽,亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制劑: 各1 μg/ml
* Na3VO4: 1 mM
* NaF: 1 mM
實驗流程為:
1.用磷酸鹽緩沖液洗30塊10 cm培養板上的適宜細胞。刮去每塊板上的細胞到1 ml冰冷的EBC裂解緩沖液中。
2.將每毫升細胞懸液轉移到微量離心管中,在微量離心機上4℃以zui大速度離心15 min。
3.收集上清(約30 ml)并加入30μg的適當抗體,4℃搖動免疫沉淀物1 h。
4.加入0.9 ml的蛋白質A-Sepharose 懸液,4℃搖動免疫沉淀物30 min。
5.用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物,再重復洗5次。zui后,用NETN洗一次。
6.吸出混合物的液體部分。加入800μl的1×SDS膠加樣緩沖液到球珠中,煮沸4 min。
7.將樣品加入到大孔的不連續SDS-PAGE梯度膠中,在10 mA的恒定電流下電泳。
8.通過考馬斯藍染色觀察蛋白質泳帶。
9.從膠上切下目標帶,將其放到微量離心管中,用1ml 50%乙腈洗兩次,每次3 min。
10. 用胰蛋白酶消化膠中的蛋白質,再將肽電洗脫。
11. 通過窄孔液相色譜分離肽。將收集的肽在ABI 477A或494A機器上進行自動Edman降解測序。
注意事項
1. 細胞裂解采用溫和的裂解條件,不能破壞細胞內存在的所有蛋白質-蛋白質相互作用,多采用非離子變性劑(NP40 或Triton X-100)。每種細胞的裂解條件是不一樣的,通過經驗確定。不能用高濃度的變性劑(0.2%SDS),細胞裂解液中要加各種酶抑制劑,如商品化的 cocktailer。
2. 使用明確的抗體,可以將幾種抗體共同使用
3. 使用對照抗體:
單克隆抗體:正常小鼠的IgG或另一類單抗
兔多克隆抗體:正常兔IgG
4. 在免疫共沉淀實驗中要保證實驗結果的真實性,應注意以下幾點:
   1) 確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的,而并非外源非特異蛋白,單克隆抗體的使用有助于避免污染的發生;
   2) 要確保抗體的特異性,即在不表達抗原的細胞溶解物中添加抗體后不會引起共沉淀;
   3) 確定蛋白間的相互作用是發生在細胞中,而不是由于細胞的溶解才發生的,這需要進行蛋白質的定位來確定。

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