放大倍數是評判光學顯微鏡性能的一項重要標準。本報告向數字顯微用戶提供指南，幫助確定放大倍數值的有效范圍。

150 多年來，光學顯微鏡使用玻璃鏡片聚光和放大，從而對肉眼無法看見的顯微實體進行觀察【1】。目前，光學顯微鏡有多種類型，但本文主要針對zui常用的兩種進行說明：數字顯微鏡【2】，其配備了電子圖像傳感器，但未配備目鏡；以及目測顯微鏡【3、4】，其配備目鏡。此外，目測顯微鏡還可配備數字照像機，從而具備數字顯微鏡類似功能。

放大倍數是顯微鏡按照比例生成比物體實際大小更大（或更小）的圖像的能力。使用放大倍數是為了能夠在圖像中將物體看得更加具體，而不僅僅是使用肉眼觀察物體。目前，使用顯微鏡目鏡觀察標本圖像的放大倍數已有明確限定。標準對此具有嚴格規定，并已記錄在案【5-9】。諸多此類標準亦適用于數字顯微，數字顯微鏡大多使用電子監視器觀察圖像，對數字顯微鏡放大倍數的嚴格定義和標準仍有待進一步發展。

數字顯微鏡以及配備了數字照像機的目測顯微鏡均能快速采集圖像。二者多用于不同領域和行業的各類技術應用【10、11】。

一

數字顯微放大倍數

1基本定義

放大倍數究竟是什么？放大倍數的基本定義是指，在光學系統中觀察到的物體或樣品個體特征的大小與物體本身個體特征的實際大小之比。因此，橫向放大倍數 MDIS 可定義為：

表達式 1

注意，觀察到的視覺放大倍數有效范圍主要取決于顯微鏡系統的zui大分辨率。若放大倍數超過有效范圍，則無法更具體地觀察樣品。這種情況被稱為無效放大【12、13】。根據zui大分辨率，觀察距離的有效范圍，即光學顯示器和觀察者肉眼之間的距離，可根據實際情況確定。

2數字顯微鏡或配備數字照像機的目測顯微鏡

使用目測顯微鏡目鏡觀察圖像時，總體（橫向）放大倍數定義如下【8】：

表達式 2

式中：

• MTOTVIS 是指通過目鏡觀察的總體橫向放大倍數；

• MO是指物鏡放大倍數；

• q 是指總體鏡筒系數（變焦和其他鏡筒鏡片）；以及

• ME=目鏡放大倍數。

檢測投影到電子傳感器上的顯微鏡圖像時，例如數字照像機的圖像，傳感器中形成的圖像放大倍數如下所示【8】：

表達式 3a

表達式 3b

式中：

• MTOTPROJ是指顯微鏡的（橫向）放大倍數（投影到傳感器上的圖像）；

• p 是指目鏡到照像機之間的投影系數；以及

• MPHOT是指鏡筒到照像機之間照相投影透鏡的放大倍數。

總體鏡筒系數 q 一般在 0.5:1 和 25:1 之間。照相投影透鏡放大倍數 MPHOT 一般在 0.32:1 和 1.6:1 之間。

數字顯微鏡未配備目鏡，因此圖像投影到數字照像機電子傳感器上，并由其進行檢測，然后顯示在電子監視器上，進行觀察。在配備數字照像機的目測顯微鏡中使用監視器觀察圖像亦是如此。因此，數字顯微的zui終總體放大倍數MDIS（表達式 1）取決于監視器的實際像素比。其定義如下：

表達式 4

式中，MDIS是指顯示器顯示圖像的總體橫向顯示放大倍數，像素比是指照像機與電子監視器顯示器之間利用信號傳送圖像時，圖像的“放大”程度。像素大小比例根據監視器的像素大小與照像機傳感器的像素大小之比而確定。

表達式 5

此處假設圖像按照1比1的像素對應模式從照像機組件顯示到監視器中，屬于zui簡單的情況。在這種顯示模式中，根據監視器的像素數，監視器中僅能觀察到部分圖像。

數字顯微示例如下圖 1：數字顯微鏡和配備數字照像機的立體顯微鏡所示。

a）配備 DFC450 數字照像機的Leica M205 C 立體顯微鏡。通過目鏡或電子顯示器監視器可觀察到螞蟻樣品，使用照像機對圖像進行檢測。

b）

c）

b) 和 c) Leica DMS1000 數字顯微鏡利用各種監視器尺寸顯示圖像

3分辨率

一般說來，光學儀器的分辨率是具體觀察圖像的能力。具體的說，分辨率是辨別物體圖像緊密排列的相鄰點或相鄰線的能力。通常，不論采用哪種分辨率定義，兩種術語的使用意義都相同。顯微鏡中，分線率以線對/毫米表示。也就是說，黑白線對及其厚度和線距均可在一定的分辨率下辨別。

放大倍數大但分辨率不足會導致無效放大，如上所述【12、13】。因此，必須了解分辨率的限制因素，不僅包括數字顯微，還包括所有類型的光學顯微。

4照像機傳感器和顯示器監視器像素數和像素大小

徠卡纖維系統制造的所有顯微鏡數字照像機中使用的傳感器，一般情況下，像素數均在 1,600 x 1,200 到 4,080 x 3,072 之間，像素大小在 2 到 6.5μm 之間（示例見表 1）。高清（HD）計算機監視器或電視的像素為 1,920 x 1,200 或 1,080，像素大小在 0.1 到 0.9mm 之間（示例見表 2）【14、15】。因此，監視器像素一般是照像機像素的 25 到 450 倍。

表 1：Leica DFC450 和 MC120/170 高清照像機和 Leica DMS300/1000 數字顯微鏡使用的圖像傳感器規格

表 2：高清電子監視器顯示器示例：計算機監視器或電視

5像素大小比例

了解了照像機傳感器的一般像素大小（表 1）和高清平板監視器的一般像素大小（表 2），即可利用表達式 5（表3）計算出大小比值。

表 3：高清監控器（表 2）與Leica DMS1000/DMS300 數字顯微鏡、以及Leica MC170/MC120 高清照像機和DFC450數字照像機（表 1）的像素大小比例（表達式 5）

二

示例：數字顯微鏡和配備數字照像機的立體顯微鏡

為簡單起見，本報告僅探討 2 個數字顯微示例，即數字顯微鏡和配備數字照像機的立體顯微鏡。假設，使用1比1照像機-監控器像素對應，將圖像投影到高清監控器上，大小范圍在 21.5”（對角線尺寸為 21.5 英寸【1365px】）到7”（對角線尺寸 74.5英寸【4725px】）之間。2 個示例分別是數字顯微鏡 Leica DMS1000 以及安裝了C-mount 的Leica MC170 高清數字照像機的立體顯微鏡 Leica M205 A。表 4 說明了配備 MC 170 高清照像機的 Leica DMS1000 或M205 A 能夠達到的總體放大倍數值示例。Leica DMS1000 的物鏡放大倍數范圍在 0.32x 到 2x 之間，鏡筒系數（q）包括照相投影透鏡，其范圍為 8.4:1。配備 MC170 高清照像機的 Leica M205 A，其物鏡放大倍數范圍在 0.5x 至 2x 之間，變焦范圍在 0.78x 至 16x 之間，目鏡放大倍數范圍在 10x 至 25x 之間，C-mount 透鏡放大倍數范圍在 0.4x 至 1x 之間。

表 4：Leica DMS1000 數字顯微鏡以及配備 Leica MC170 高清數字照像機的 Leica M205 A 立體顯微鏡的總體放大倍數數據MTOT VIS和MDIS（表達式 2 和表達式 4）。探討的高清監控器大小（表 2）和像素比（表 3）可能適用的zui大和zui小放大倍數值范圍。

130，000:1 放大倍數

監控器總體橫向顯示放大倍數達到30,000:1 需要多大的像素呢？如下示例采用配備 MC170 高清照像機的 Leica M205 A 以及表達式 3b、表達式 4 和表達式 5。M205 A 在照像機傳感器上投影的樣品圖像的zui大放大倍數為：

像素比值對應總體放大倍數30,000:1，其在傳感器上的放大倍數為32x，其值為：

Leica MC170 高清照像機傳感器的像素大小為 2.35μm。使用上述像素比值 938:1，且照像機-監控器像素1比1對應，監控器像素大小應為：

因此，為使 LeicaM205 A和 MC170 高清數字照像機的總體放大倍數達到 30,000:1，監控器像素大小應為 2.2mm。這一像素大小對應的高清監控器對角線為 4.9m。

三

數字顯微放大倍數的有效范圍

現在，肯定有人會問，30,000:1 的放大倍數是否超過了有效范圍，成了無效放大？使用監控器觀察圖像時，我們應該如何確定數字顯微放大倍數的有效范圍呢？首先必須深入了解顯微鏡系統分辨率以及觀察距離。

1顯微鏡系統分辨率

數字顯微鏡（或配備數字照像機的立體顯微鏡）系統分辨率主要由 3 個因素決定：

• 光學分辨率：

表達式 6

式中，NA 是指數值孔徑，λ 是指光的波長，單位為 nm；

• 圖像傳感器（照像機傳感器）分辨率：

式中，MTOT PROJ是指樣品在傳感器上的放大倍數（表達式 3），“傳感器像素合并模式”是指像素合并模式，1 表示全幀，2 表示 2x 2像素合并，以此類推（參見圖 2），“像素大小”是指傳感器像素大小，單位為μm；以及

• 圖像顯示器（監控器）分辨率：

式中，MDIS是指總體橫向放大倍數（表達式 4），監控器像素大小單位為 mm。

照像機傳感器和顯示器監控器分辨極限是根據處理數字信號的奈奎斯特頻率或采樣頻率定理而確定（參見圖 2）【16】。該定理假設分辨 1 個線對至少需要 2 個像素。本報告中，如上所述，*案例是假設傳感器像素和監控器像素 1 比1 對應。因此，使用表達式 4，將監控器像素大小轉化成以μm 為單位，從而明確傳感器和監控器分線率限值一致。

數字顯微鏡系統分辨極限根據上述 3 個分辨率值的zui小值而確定。

a）

b）

圖 2a-b：a）照像機傳感器檢測圖像的像素合并模式示例：無合并（全幀 1x1）、雙重合并（2x2）、三重合并（3x3）、四重合并（4x4），以及b）照像機傳感器檢測黑/白線對的像素合并模式示例，其用于測量顯微鏡的分辨極限，每個線對（奈奎斯特頻率）至少需要2 個像素（紅色方塊）。但是，如果每個線對使用 3 個或 3個以上像素，則圖像效果會更好。

2觀察距離的有效范圍

觀察距離是指觀察者肉眼和顯示圖像之間的距離。觀察距離的有效范圍由顯微鏡系統分辨率和觀察者的分辨視角確定【17】。一般情況下，標準人眼的分辨視角為 2.3 至 4.6 弧分。也就是說，監控器間距與特定觀察距離角度相差 2.3 至 4.6 弧分的情況下，人眼能夠分辨監控器上的具體細節。觀察距離的有效范圍表達式如下所示：

式中，MDIS是指總體橫向放大倍數（表達式 4），“系統分辨率”是指上述顯微鏡分辨極限。

本文的探討內容假設觀察距離在有效范圍內。

3放大倍數的有效范圍

為了解如何確定數字顯微放大倍數的有效范圍，即在顯示器監控器上觀察放大的圖像，首先需要簡要說明目測物體圖像觀察到的放大倍數。利用幾何光學，可以獲得下列表達式：

式中，MDIS是指總體放大倍數（表達式1），250 是指觀察距離的標準參照，單位為 mm，其根據人眼的平均近點確定。

現在，放大倍數的有效范圍可以結合表達式 9 和表達式 10 進行zui終確定：

因此，放大倍數的有效范圍為顯微鏡系統分辨率的 1/6 到 1/3 之間。

• 高倍放大

新式照像機傳感器的像素大小范圍在 1-6μm 之間，遠低于 10μm。使用傳感器高倍放大樣品時，例如：150:1，且無像素合并，傳感器和監控器像素1比1對應，則根據上述表達式 6、表達式 7 和表達式 8，可以得出，顯微鏡系統分辨率根據光學分辨極限進行確定。zui大數值孔徑接近 1.3，可見光的zui小波長約為 400 nm，則光學分辨極限為 5,400 線對/mm。同等條件下，像素大小低于 10 μm 的照像機傳感器，其分辨極限很容易超出這一數值。具體案例條件下，根據上述表達式 11，數值有效范圍內zui大放大倍數為 1,800x。

• 低倍放大

使用照像機傳感器中以小于等于 1x的放大倍數低倍放大樣品時，數值孔徑一般低于 0.03.照像機傳感器的像素大小越大于 2 微米，其分辨極限越低于此類低倍放大的光學分辨率。因此，以小于等于 1x 的放大倍數低倍放大時，傳感器或監控器分辨極限更可能成為顯微鏡系統分辨率的主導因素。

• 無效放大

此處探討的數字顯微是假設始終在上述有效的觀察距離范圍內觀察監控器圖像。只要觀察到的放大倍數值超過有效放大倍數范圍，即 1,800x，則無法更具體地分辨樣品。

四

物場（視場）

物場（OF）是zui終圖像中產生的物體組成部分。也稱作顯微鏡視場（FOV）。因此，某一物體的具體細節只有在物場中呈現出來，才能進行觀察。

通過目鏡進行觀察時，物場呈現的是部分樣品的可見圓形圖像。物場大小（參見表達式 12）根據目鏡視場直徑（FN）以及物鏡和鏡筒透鏡（參見圖 3）的放大倍數而確定。

數字顯微的物場由于接收圖像的圖像傳感器和顯示圖像的監控器二者的性質而呈現為長方形（參見圖 3）。其寬度和高度單位為毫米。數字顯微應注意光學系統創建的圖像大小要足以覆蓋整個圖像傳感器。在這種情況下，應根據顯示像素的數量、高度、寬度及其實際大小（像素間距），考量顯示區域的實際大小。

為計算物場，傳感器顯示區域的實際大小（參見表達式 13）應根據物鏡、鏡筒以及照像機投影透鏡的放大倍數（MTOT PROJ）或監控器的總體橫向顯示放大倍數MDIS進行劃分。根據各高度和寬度中較小的數值確定數字顯微鏡的物場。

物場的高度和寬度無需由圖像傳感器或顯示器一同進行限制。例如，高度可由顯示器進行限制，但寬度可由傳感器進行限制。zui終物場將根據圖像傳感器和顯示器的尺寸和縱橫比以及二者顯示圖像的像素對應（1:1、1:2、2:1 等）進行確定。本報告中，假設傳感器像素與監控器像素1比1對應。

目鏡物場根據下列表達式進行確定：

表達式 12

式中：

• OF目鏡是指通過目鏡觀察到的物場；

• FN 是指目鏡視場直徑；以及

• MO× q（參見表達式 2）是指目鏡根據物鏡、變焦以及目鏡前其他鏡筒透鏡而做出的總體放大倍數。

圖像傳感器的物場可利用傳感器的寬度和高度進行確定，根據在傳感器上生成樣品圖像的光學器件的總體放大倍數進行劃分：

式中：

• w 是指傳感器觀察到的物場寬度；

• h 是指傳感器觀察到的物場高度；

• MTOTPROJ 是指樣品在傳感器上的總體放大倍數（表達式 3b）；以及

• 像素大小單位為 μm。

就同一樣品而言，通過目鏡觀察到的圖像與照像機組件記錄的圖像之間的物場差異、物鏡以及變焦設置如下列圖 3 和圖 4 所示。圖 4 中，物鏡和變焦透鏡的總體放大倍數為 1x，但放大倍數不同的幾類 Leica C-Mount 多會安裝 Leica DFC450 照像機，其2/3 組件位于 Leica M205 A 立體顯微鏡上。圖 4 的紅色長方形表示圖 4b 中采用 0.32x C-mount 的圖像物場。藍色長方形表示圖 4c 中采用 0.5x C-mount 的圖像物場。綠色長方形表示圖 4d 中采用 0.63x C-mount 的圖像物場。圖 4b 表示光暈問題，即圖像邊緣與中心相比較暗。為避免此類問題，一般情況下，建議采用 0.32x C-mount 時，使用組件大小為 1/3''（8.45mm）的數字照像機；采用0.4x C-mount時，使用組件大小為1/2.3''（11mm）的數字照像機；采用0.5x C-mount時，使用組件大小為1/2''（12.7mm）的數字照像機；采用0.63x C-mount時，使用組件大小為 2/3''（16.9mm）的數字照像機。

a）

b）

圖 3：示意圖直接對比徠卡顯微系統的目鏡（白色圓形）觀察到的圖像以及數字照像機組件（長方形）同時觀察到的圖像。示例 2 表明：a）視場直徑（FN）為 20mm 且配備C-mount 0.4x 透鏡的目鏡；以及b）視場直徑為 23mm且配備C-mount 0.5x 透鏡的目鏡。某些照像機檢測圖像以縱橫比 4:3（紅色長方形）的格式存儲數據，以縱橫比 16:9（綠色長方形）的格式輸出即時圖像。

a）利用視場直徑為 23mm 的 10x 目鏡進行拍攝，并使用配備 Leica C-mount（MPHOT）的 Leica DFC450 數字照像機進行記錄

b)0.32x MPHOT，且物場為27.2×20.3 mm

c）0.5x MPHOT，且物場為17.4×13 mm

d）0.63x MPHOT，且物場為13.8 × 10.3 mm

圖 4：Leica M205 A 立體顯微鏡觀察到的西門子星形圖像，該顯微鏡物鏡和變焦透鏡的總體放大倍數（MO × q）為 1x。第 1 個黑色線圈直徑為 10mm，第 2 個黑色線圈直徑為 20mm（參見 4a 和 4b）。4a 中的紅色長方形表示 4b 的物場（0.32x C-mount），藍色長方形表示 4c 的物場（0.5x C-mount），綠色長方形表示 4d 的物場（0.63x C-mount）。

照像機傳感器的物場（OF）可利用上述表達式 13 進行計算。Leica DMS1000和配備 MD170 高清照像機的 Leica M205 A 的物場數值范圍如表 5 所示。同樣，Leica DMS1000 的放大倍數范圍為：物鏡 0.32x 至 2x，鏡筒系數（q）（包括照相投影透鏡）比例為 8.4:1,；配備 MD170 高清照像機的 Leica M205 A的放大倍數范圍為：物鏡0.5x 至 2x，變焦0.78x 至 16x，C-mount 0.4x 至 1x。

表 5：Leica DMS1000 數字顯微鏡和配備MC170 高清數字照像機的 Leica M205 A立體顯微鏡觀察到的圖像物場（OF）數據（表達式 13）表示了zui大和zui小數值范圍。

“總結 歸納”

數字顯微鏡利用電子圖像傳感器（照像機傳感器）替代目鏡。目測顯微鏡，例如立體顯微鏡，具有目鏡，且可配備數字照像機。數字顯微可以快速采集圖像。多用于各種領域的快速簡便存檔、質量控制（QC）、故障分析以及研發（R&D）。

由于照像機傳感器尺寸和電子顯示器監控器大小種類繁多，因此使用數字顯微確定放大倍數和分辨率有一定困難。本報告旨在幫助數字顯微用戶深入了解如何評估總體放大倍數及其有效范圍。同時亦對物場或視場的有效數據進行了探討。