維生素B12(VB12)ELISA試劑盒使用目的：

本試劑盒用于測定食品(牛奶等)相關樣本中維生素 B12（VB12）含量。

維生素B12(VB12)ELISA試劑盒實驗原理：

本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中維生素 B12 （VB12） 水平。 用純化的維生素 B12

（VB12）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入維生素 B12（VB12） ，再與 HRP 標記的維生素 B12（VB12）抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過*洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的維生素 B12（VB12）呈正相關。用酶標儀在 450nm 波長下測定吸光度（OD 值） ，通過標準曲線計算樣品中維生素 B12（VB12）濃度。

維生素B12(VB12)ELISA試劑盒組成：

1  30 倍濃縮洗滌液  20ml×1 瓶  7  終止液  6ml×1 瓶

2  酶標試劑  6ml×1 瓶  8  標準品（800ng/L）  0.5ml×1 瓶

3  酶標包被板  12 孔×8 條  9  標準品稀釋液  1.5ml×1 瓶

4  樣品稀釋液  6ml×1 瓶  10  說明書  1 份

5  顯色劑 A 液  6ml×1 瓶  11  封板膜  2 張

6  顯色劑 B 液  6ml×1/瓶  12  密封袋  1 個

維生素B12(VB12)ELISA試劑盒標本要求：

1．標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能

馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融

2．不能檢測含 NaN3 的樣品，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

維生素B12(VB12)ELISA試劑盒操作步驟

1.  標準品的稀釋： 本試劑盒提供原倍標準品一支， 用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。

400ng/L  5 號標準品  150μl 的原倍標準品加入 150μl 標準品稀釋液

200 ng/L  4 號標準品  150μl 的 5 號標準品加入 150μl 標準品稀釋液

100 ng/L  3 號標準品  150μl 的 4 號標準品加入 150μl 標準品稀釋液

50 ng/L  2 號標準品  150μl 的 3 號標準品加入 150μl 標準品稀釋液

25 ng/L  1 號標準品  150μl 的 2 號標準品加入 150μl 標準品稀釋液

2.  加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同） 、標準孔、待測樣品孔。 在酶標包被板上標準品準確加樣 50μl， 待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40μl，然后再加待測樣品 10μl（樣品zui終稀釋度為 5 倍） 。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

3.  溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 30 分鐘。

4.  配液：將 20 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 20 倍稀釋后備用

5.  洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此

重復 5 次，拍干。

6.  加酶：每孔加入酶標試劑 50μl，空白孔除外。

7.  溫育：操作同 3。

8.  洗滌：操作同 5。

9.  顯色：每孔先加入顯色劑 A50μl，再加入顯色劑 B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色分鐘.

10. 終止：每孔加終止液 50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色） 。

11. 測定：以空白空調零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值） 。 測定應在加終止液后 15 分鐘以內進行。

維生素B12(VB12)ELISA試劑盒計算：

以標準物的濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的

OD 值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與 OD 值計算出標準曲線的直線回歸方程式， 將樣品的 OD 值代入方程式， 計算出樣品濃度， 再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

維生素B12(VB12)ELISA試劑盒注意事項：

1．試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未

用完，板條應裝入密封袋中保存。

2．濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。

3．各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間

控制在 5 分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。

4． 請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本 OD 值

大于標準品孔*孔的 OD 值） ，請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n 倍）后再測定，計

算時請zui后乘以總稀釋倍數（×n×5） 。

5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6．底物請避光保存。

7．嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.

8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。

9．本試劑不同批號組分不得混用。

維生素B12(VB12)ELISA試劑盒保存條件及有效期：

1．試劑盒保存：2-8℃。

2．有效期：6個月