關于血球計數板的使用及問題討論

一、血球計數板的使用原理

顯微鏡直接計數法是將小量待測樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上（又稱計菌器），于顯微鏡下直接計數，然后推算出含菌數的一種方法。血球計數板是常用的計菌器之一。

血球計數板是一種專門用于計算較大單細胞微生物的一種儀器，由一塊比普通載玻片厚的特制玻片制成的玻片中有四條下凹的槽，構成三個平臺。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽隔為兩半，每半邊上面刻有一個方格網。方格網上刻有9個大方格，其中只有中間的一個大方格為計數室。這一大方格的長和寬各為1mm，深度為0.1mm,其容積為0.1mm³，即1mm×1mm×0.1mm方格的計數板；大方格的長和寬各2mm,深度為0.1mm,其容積為0.4mm³，即2mm×2mm×0.1mm方格的計數板。在血球計數板上，刻有一些符號和數字，其含義是：XB-K-25為計數板的型號和規格，表示此計數板分25個中格；0.1mm為蓋上蓋玻片后計數室的高；1/400mm²表示計數室面積是1mm²，分400個小格，每小格面積是1/400 mm²。

計數室通常也有兩種規格：一種是16×25型，即大方格內分為16中格，每一中格又分為25小格；另一種是25×16型，即大方格內分為25中格，每一中格又分為16小格。但是不管計數室是哪一種構造，它們都有一個共同的特點，即每一大方格都是16×25=25×16=400個小方格組成。

1．16×25型的計數板  將計數室放大，可見它含16中格，一般取四角：1、4、13、16四個中方格（100個小方格）計數。將每一中格放大，可見25個小格。計數重復3次，取其平均值。計數完畢后，依下列公式計算：

酵母細胞個數／1mL=100個小方格細胞總數/100 ×400×10000×稀釋倍數

2．25×16型的計數板  中央大方格以雙線等分成25個中方格，每個中方格又分成16個小方格，供細胞計數用。一般計數四個角和中央的五個中方格（80個小方格）的細胞數。計數重復3次，取其平均值。計數完畢后，依下列公式計算：

酵母細胞個數／1mL ＝80個小方格細胞總數/80 ×400×10000×稀釋倍數

血球計數板的構造（三）（25×16）

a．頂面觀  b．側面觀  c．放大后的網格  d．放大后的計數室

二、血球計數板的使用方法步驟

1．鏡檢計數室。在加樣前，先對計數板的計數室進行鏡檢。若有污物，則需清洗，吹干后才能進行計數。

2．加樣品。將清潔干燥的血球計數板的計數室上加蓋的蓋玻片，用吸管吸取稀釋后的酵母菌懸液，滴于蓋玻片邊緣，讓培養液自行緩緩滲入，一次性充滿計數室，防止產生氣泡，充入細胞懸液的量以不超過計數室臺面與蓋玻片之間的矩形邊緣為宜。多余培養液可用濾紙吸去。

3．計數。稍待片刻（約5min），待酵母菌細胞全部沉降到計數室底部后，將計數板放在載物臺的中央，先在低倍鏡下找到計數室所在位置后，再轉換高倍鏡觀察、計數并記錄。

三、血球計數板的使用注意事項

《培養液中酵母菌種群數量的動態變化》實驗是一個歷時較長（7天左右）的實驗，事前一定要做好周密的計劃，定程序、定時間、定人員。每天采用抽樣檢測法使用血球計數板對酵母菌進行計數，在計數時應從以下幾方面注意：

1．每天同一時間，各組取出本組的試管，用血球計數板計數酵母菌個數，并作記錄，連續觀察7天。

2．從試管中吸出培養液進行計數之前，要將試管輕輕震蕩幾下，這樣使酵母菌分布均勻，防止酵母凝聚沉淀，提高計數的代表性和準確性，求得的培養液中的酵母菌數量誤差小。

3．如果一個小方格內酵母菌過多，難以數清，應當對培養液進行稀釋以便于酵母菌的計數。具體方法是：搖勻試管，取1mL酵母菌培養液，加入成倍的無菌水稀釋，稀釋n倍后，再用血球計數板計數，所得數值乘以稀釋倍數。以每小方格內含有4—5個酵母細胞為宜。特別是在培養后期的樣液需要稀釋后計數。

4．活酵母有芽殖現象，若芽體達到母細胞大小的一半時，即可作為兩個菌體計數，若芽體小于母細胞一半時為1個酵母細胞。

5．對于壓在方格界線上的酵母菌應當計數同側相鄰兩邊上的菌體數，一般可采取“數上線不數下線，數左線不數右線”的原則處理，另兩邊不計數。計數時，如果使用16格×25格規格的計數室，要按對角線位，取左上、右上、左下、右下4個中格(即100個小格)的酵母菌數；如果規格為25格×16格的計數板，除了取其4個對角方位外，還需再數中央的一個中格(即80個小方格)的酵母菌數。

6．計數一個樣品要從兩個計數室中計得的平均數值來計算，對每個樣品可計數三次，再取其平均值。計數時應不時調節焦距，才能觀察到不同深度的菌體。按公式計算每1ml（或10mL）菌液中所含的酵母菌個數。

7．血球計數板的清潔

血球計數板使用后，用自來水沖洗，切勿用硬物洗刷，洗后自行晾干或用吹風機吹干，或用95%的乙醇、無水乙醇、丙酮等有機溶劑脫水使其干燥。通過鏡檢觀察每小格內是否殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復清洗直到干凈為止

四、關于血球計數板的命題

由于實驗《培養液中酵母菌種群數量的動態變化》是新教材新增加的實驗，在各地各類命題中都關注了這一實驗，并對血球計數板的使用進行了命題設計。從近年來的各類試題來看，試題考查的角度不同，大多數是關于細胞數量的計算，也有關于使用原理和方法的考查，但有的試題明顯與血球計數板的實際使用不相符。

例1 在用血球計數板（2mm×2mm方格）對某一稀釋50倍樣品進行計數時，發現在一個方格內（蓋玻片下的培養液厚度為0.1mm）酵母菌平均數為16，據此估算10mL培養液中有酵母菌       個。　（參考答案： 2×10⁷）

例2 在“探究培養液中酵母菌種群數量的變化”實驗中，某同學用顯微鏡觀察計數，統計發現血球計數板的小方格(2 mm×2 mm)內酵母菌數量的平均值為13個。假設蓋玻片下的培養液厚度為0.1 mm，那么10mL培養液中酵母菌的個數約為      個。 （參考答案：Ｂ）

A．5.2×10⁴    B．3.25×10⁵        C．5.2×10³    D.3.25×10⁴

解析一：例1例2兩題，均將整個計數室2mm×2mm方格作為實驗計數的空間，并按照公式：a/4×10⁵（×稀釋倍數）來計算10mL培養液中的酵母菌的數量（a為所計數酵母菌的平均數）。與血球計數板的實際操作不相符，特別是例2中將2mm×2mm的計數室當成一個小方格了，存在有科學性錯誤。  

例3 通常用血球計數板對培養液中酵母菌進行計數，若計數室為1mm×1mm×0.1mm方格，由400個小方格組成，如果一個小方格內酵母菌過多，難以計數，應先　　后再計數。若多次重復計數后，算得每個小方格中平均有5個酵母菌，則10mL該培養液中酵母菌總數有　　　　個。（參考答案：稀釋；2×10⁸）

解析二：例3設計了血球計數板的規格，還考查了血球計數板的使用方法，較例1例2更科學合理。根據公式：5×400×10000×10＝2×10⁸。

例4  檢測員將1 mL水樣稀釋10倍后，用抽樣檢測的方法檢測每毫升藍藻的數量；將蓋玻片放在計數室上，用吸管吸取少許培養液使其自行滲入計數室，并用濾紙吸去多余液體。已知每個計數室由25×16＝400個小格組成，容納液體的總體積為0．1 mm³。

解析三：從例4來看，是按照血球計數板的原理進行設計試題的，還添加了相應的圖示，題意一目了然。按照前面所述的公式，不難得出正確答案：酵母細胞個數／1mL＝80個小方格細胞總數/ 80 ×400×10000×稀釋倍數＝n/ 80×400×10000×10＝5n×10⁵