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【干貨】活細胞熒光成像新型標記法在STED中的應用(上)

來源:北京冠普佳科技有限公司   2015年03月10日 13:10  

作者:張坤博士

徠卡顯微系統 生命科學部 應用專員

 

熒光顯微鏡在研究活細胞中蛋白質分子的定位、相互作用及動力學等生命活動中起著*的作用。將熒光蛋白如綠色熒光蛋白和目的蛋白融合表達,然后利用熒光蛋白發出的特異性熒光來觀察和追蹤目的蛋白分子在科學研究中得到了廣泛的應用。但是熒光蛋白具有量子產量低、成熟速度受限、光譜容易受到環境因素影響及容易形成聚集體等缺點,這些在一些特殊的顯微熒光成像中會造成假象而影響zui終的實驗結果。因此,科學家們也開始尋找、發明越來越合適的活細胞標記方法,以配合越來越的顯微成像(如超高分辨率等)技術來更加真實的觀察、記錄各種微觀生命活動。本文中重點介紹了SNAP-tag和SiR等新型標記方法和染料的特征及應用

 

 

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SNAP-tag技術簡介

 

圖1. SNAP-tag標記示意圖。該標記方法具有特異性高、速度快、穩定性高及熒光探針選擇靈活多樣等優點。該圖片來自www.covalys。。com.

 

如何才能將活細胞中的目的蛋白標記上特異的熒光信號呢?談到特異性,科學家們首先考慮到的是酶和底物的相互作用。因此,從酶促反應出發,瑞士洛桑理工學院的Kai Johnsson科研小組發現人類DNA修復酶(alkylguanine-DNAalkyltransferase,AGT)可以特異性并快速地與苯甲基鳥嘌呤(benzylguanine, BG)衍生物發生反應,以共價鍵結合。隨后,對AGT進行了突變改造,獲得了一種不與DNA鏈上的鳥嘌呤進行反應的蛋白Snap-tag,該蛋白不再定位于細胞核中,但與小分子BG衍生物的親和力卻大大地提高現在[1-2]。SNAP-tag只有20KDa大小,因此可以將目的蛋白與SNAP-tag融合表達。將帶有熒光探針標記的BG導入細胞后,BG與SNAP-tag會快速的發生共價反應,從而實現活細胞中特異性目的蛋白的熒光標記(圖1)。科學家可以特異性的選擇細胞膜通透性的或非通透性的BG底物,分別用于研究膜表面分子和細胞質內表達的分子[3]。相對于熒光蛋白表達,SNAP-tag標記的zui大的優點是熒光探針的靈活選擇性,如熒光染料、量子點、金顆粒及光激活、光轉換的染料等,目前NEB等公司已經將SNAP-tag的表達載體和這些底物廣泛商品化,熒光探針的光譜選擇也非常靈活(表1)。鑒于其使用的便捷性,SNAP-tag已經得到了廣泛應用,如用于研究蛋白的半衰期、運輸及相互作用等[4-6]。Johnsson研究小組通過對SNAP-tag進行改造,獲得了一種新的CLIP-tag,經過基因改造,使其不與芐基鳥嘌呤衍生物結合,而與芐基胞嘧啶衍生物(Benzylcytosine, BC)結合[7]。CLIP-tag與SNAP-tag聯合使用,能夠同時標記同一個細胞中兩個不同的蛋白,使這種tag自我標記型的標記方法的應用得到了進一步的拓展[8-11](表1)。在實際操作中,研究者將熒光標記的底物加入表達SNAP-tag或CLIP-tag的細胞中,待結合完成后清洗幾次以去除未結合的熒光底物即可進行成像,非常簡單便捷。

 

 

表1.目前NEB公司提供的多種多樣的SNAP-tag和CLIP-tag底物。資料來自https://www.neb。。com/tools-and-resources/selection-charts/snap-tag-clip-tag-and-acp-mcp-tag-substrate-selection-chart。

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SNAP-tag技術在STED超高分辨率顯微成像中的應用

近十年中,顯微成像技術得到了飛躍的發展,*光學顯微鏡(~200 nm)到電子顯微鏡(~0.1 nm)分辨率缺口,打破光學衍射極限的超高分辨率顯微鏡也越來越趨于成熟化。其中,德國馬普研究所的Stefan Hell教授憑借其研發的受激發射損耗(Stimulatedemission depletion,STED)技術榮獲2014年的諾貝爾化學獎。STED超高分辨率顯微鏡是架構在共聚焦顯微鏡上,因此其成像速度非常快,可以廣泛的應用于活細胞的超高分辨率成像。除了傳統的YFP等熒光蛋白可以用于STED活細胞超高分辨率成像,SNAP-tag和CLIP-tag可以非常簡便的的將AlexaFluo等有機染料引入活細胞,實現活細胞中多色超高分辨率成像。有機染料具有更好的光穩定性,光譜的選擇也更加靈活,配合SNAP-tag和CLIP-tag標記的特異性和穩定性,可以更的服務于長時間的活細胞超高分辨率顯微成像。Joerg B等科學家用SNAP-tag/BG-94和CLIP-tag/BC-647分別標記了表皮生長因子受體(EGFR)和表皮生長因子(EGF)(圖2),利用STED超高分辨率顯微鏡解析了兩者在活細胞中的相互作用(圖3)[12]。

圖2.SNAP-tag/BG-494和CLIP-tag/BC-647N分別標記EGFR和EGF的示意圖。原則上EGFR和EGF結合后會形成同源二聚體,在這里考慮到示意圖的簡潔清晰性,EGFR仍然以單體的形式表示。圖片來自Two-colorSTED microscopy in living cells,Patrina A. P etal, Biomedical Optical Express,2011.

 

(更多活細胞熒光成像精彩內容,敬請期待下期)

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