多西他賽與吉非替尼對(duì)人肺癌細(xì)胞的作用

　　多西他賽和吉非替尼均是晚期非小細(xì)胞肺癌( non-small cell lung cancer,  NSCLC)的一線和二線治療藥物，日前兩者療效都達(dá)平臺(tái)期。除尋找新的靶向治療靶點(diǎn)外，如何進(jìn)一步提高化療和表皮生長(zhǎng)因子酪氨酸激酶抑制劑(EG FR-TKIs)的療效是晚期NSCLC面臨的問題。化療藥物與EGFR-TKIs作用的機(jī)制不同，理論上兩者同時(shí)應(yīng)用可能有增效作用。細(xì)胞學(xué)研究顯示，EG FR-TKIs聯(lián)合化療藥物能明顯增強(qiáng)對(duì)NSCLC細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，起到“1+1>2”的作用川。但是，多項(xiàng)大型臨床研究INTACTl }2} ,INTACT2}3}、TRIBUTE}4}和TALENTS均顯示EGFR-TKIs與化療同時(shí)作用在有效率及生存期方面并未優(yōu)于單獨(dú)化療，且無疾病進(jìn)展時(shí)間和疾病控制率未能提高。上述結(jié)果引發(fā)了兩個(gè)問題:(1)對(duì)于EGFR-TKIs與化療同時(shí)使用是否一也存“優(yōu)勢(shì)人群”‘了例如TRIBUTE研究中EGFR突變患者采用化療聯(lián)合厄洛替尼的有效率顯著高于野生型( 53 % vs. 18 % , P = 0. 012 ) }  ( 2 ) EGFR-TI}I與化療序貫應(yīng)用是否具增效作用，序貫應(yīng)用增效作用是否也存在“優(yōu)勢(shì)人群”‘了日本的WJTOG0203 III期臨床試驗(yàn)證實(shí)，先化療后序貫吉非替尼能夠提高肺腺癌患者的總生存時(shí)間[6es。說明化療聯(lián)合EGFR-TKIs的增效作用不僅與用藥順序有關(guān)，還可能與NSCLC細(xì)胞EGFR突變狀況有關(guān)。因此，本研究的*個(gè)日的是通過觀察多西他賽和吉非替尼不同順序用藥對(duì)EGFR野生型和EGFR突變型細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，尋找NSCLC細(xì)胞不同EGFR突變狀況的*給藥方式。

　　化療與EG FR-TKIs二者聯(lián)合應(yīng)用增效與否的細(xì)胞學(xué)機(jī)制不明。既往研究顯示，化療同時(shí)應(yīng)用EGFR-TKIs不增效的原因可能與細(xì)胞周期有關(guān)[,H }化療后序貫應(yīng)用EGFR-TKIs產(chǎn)生協(xié)同增效作用可能與EGFR磷酸化有關(guān)[91。近年的研究表明胰島素

　　樣生長(zhǎng)因子受體1( IGF-1 R)亦可通過細(xì)胞內(nèi)信號(hào)蛋自PI3 K/AKT影響細(xì)胞對(duì)化療及EG FR-TKIs敏感性[i o-i i }。因此，本研究的第二個(gè)日的旨在通過檢測(cè)多西他賽與吉非替尼不同時(shí)序應(yīng)用對(duì)EGFR野生型和突變型肺腺癌細(xì)胞的EGFR , IGF-1 R、下游信號(hào)蛋自表達(dá)磷酸化影響及細(xì)胞周期變化，尋找可能的細(xì)胞學(xué)機(jī)制。

　　材料與方法

　　1. 1材料人肺腺癌A549細(xì)胞由中科院上海細(xì)胞生物研究所提供，PC-9細(xì)胞由日本國(guó)立癌癥中心小泉史明博士惠贈(zèng)} }z}。四甲基偶氮哩鹽[3- ( 4 , 5-dime-thvlthiazol-2-vl)-2，5-diphenvl-tetrazolium   bromide，MTT、二甲基亞礬( DMSO)購(gòu)自Sigma公司。吉非替尼和多西他賽分別由阿斯利康制藥有限公司及江蘇恒瑞公司提供，均溶于DMSO中，以5 x 10-3mo1/L-20℃保存。胞外調(diào)節(jié)蛋自激酶(ERI}1/2)一抗、蛋自激酶B ( AKT)一抗、IGF-1 R一抗、內(nèi)參((3-actin ) ,磷酸化表皮生長(zhǎng)因子受體(p-EG FR)一抗、磷酸化蛋自激酶B ( p-AKT)一抗、磷酸化胰島素樣生長(zhǎng)因子受體1( p-IGF-1 R)一抗以及p-ERKl /2均購(gòu)自Cell Signa-ling公司，表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)一抗購(gòu)自SantaCruz公司，兔源及鼠源二抗購(gòu)自Cell Signaling公司，BCA試劑盒購(gòu)自Pirce公司。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自GE Healthcare公司。DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生物公司。電泳儀及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad公司，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀購(gòu)自Bioce112010公司。流式細(xì)胞檢測(cè)盒購(gòu)自碧云天公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自BeckmanCoulter公司。1. 2細(xì)胞培養(yǎng)人肺腺癌細(xì)胞A549和PC-9置于含10%胎牛血清的RPMI-1640 ( Gibc。公司)培養(yǎng)

　　液，370a ,5% a02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞單層貼壁生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)取用生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰酶消化傳代，收集備用。

　　1. 3  A549 ,Pa-9細(xì)胞的EGFR和K-Ras基因突變檢測(cè)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，胰酶消化，離心重懸后按基因組DNA提取試劑(TIANGEN)說明操作提取DNA。分別取A549,Pa-9細(xì)胞DNA產(chǎn)物8閃進(jìn)行電泳，1. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取效果。細(xì)胞EGFR及K-Ras突變檢測(cè)送蘇州為真生物醫(yī)藥有限公司，采用高分辨率溶解曲線分析技術(shù)(quantitativePCR high-resolution melting,qPCR-HRM)完成。

　　1. 4四甲基偶氮哇鹽( MTT)法檢測(cè)藥物對(duì)A549,Pa -9細(xì)胞生長(zhǎng)作用影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞，接種至96孔培養(yǎng)板，A549 100()個(gè)細(xì)胞，Pa-9 200()個(gè)。每組4個(gè)平行復(fù)孔，細(xì)胞貼壁后，再按實(shí)驗(yàn)要求分別加人100閃含有不同濃度的多西他賽或吉非替尼的培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)間換含有不同藥物的培養(yǎng)基。每孔加MTT 20},1(Sg/L)，孵育4h后棄上清，加人150,1 DMSO，振蕩15 min后酶標(biāo)儀測(cè)定492 nm波長(zhǎng)下各孔吸光值(A)，計(jì)算細(xì)胞抑制率和半數(shù)抑制濃度(IaSO}。實(shí)驗(yàn)分組:PBS對(duì)照組(a}、多西他賽單獨(dú)作用72h組(D)、吉非替尼單獨(dú)作用72h組( G) ,多西他賽作用24h序貫吉非替尼48h組( DG)、吉非替尼作用48h序貫多西他賽作用24h組(GD)和同時(shí)給藥72h組(D+G)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。抑制率=100%一(用藥組A值一空自對(duì)照A值)/(陰性對(duì)照組A值一空自對(duì)照A值)。

　　1. 5   Western hlottin。檢測(cè)細(xì)胞信號(hào)蛋白細(xì)胞按上述分組給藥處理后，將原培養(yǎng)基連同胰酶消化下的細(xì)胞離心，冷PBS洗滌3次，加人含有蛋自酶抑制劑和磷酸化蛋自酶抑制劑的裂解液，冰上提取蛋自，BCA法測(cè)定蛋自濃度，等量上樣，10%  SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%牛血清自蛋自封閉2h，一抗(1:40()一1000 ) 4 0C搖床孵育置夜，TBST洗膜lOmin x3次，二抗(1 : 2000)室溫?fù)u床孵育1h, TBST洗膜l Omin x 3次，ECL顯色后化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像。

　　以Band Scan圖像分析軟件進(jìn)行A值分析。

　　1. 6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期變化取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞及PC-9細(xì)胞接種于30cm2的培養(yǎng)皿中。A549接種1 x 10}個(gè)，PC -9接種2x10個(gè)。按上述分組給藥，消化，收集細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，用碧云天流式細(xì)胞試劑盒提取和DNA染色，流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞周期，Ce11Fit軟件進(jìn)行細(xì)胞周期分布的測(cè)定;實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

　　1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 13. 0軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間計(jì)量資料用單因素方差分析。以P < 0. OS為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　2結(jié)果

　　2. 1肺腺癌細(xì)胞EGFR和K-Ras基因表達(dá)采用qPCR-HRM對(duì)人肺腺癌A549 , PC-9細(xì)胞的EGFR基因18,19,20,21外顯子和K-Ras基因2 ,3外顯子進(jìn)行突變檢測(cè)。結(jié)果顯示，A549細(xì)胞的EGFR基因無突變，K-Ras基因第2外顯子突變。PC-9細(xì)胞的EGFR基因第19外顯子突變，K-Ras基因無突變。

　　2. 2多西他賽與吉非替尼對(duì)肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響正常培養(yǎng)的兩株肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)均呈無限繁殖，A549細(xì)胞第2天進(jìn)人對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，PC-9細(xì)胞第3天進(jìn)人對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。多西他賽和吉非替尼單藥或聯(lián)合用藥均能抑制A549和PC-9細(xì)胞生長(zhǎng)，呈濃度依賴性。多西他賽和吉非替尼作用72h抑制A549細(xì)胞生長(zhǎng)的ICS〕分)I為5. 24 x 10 -' mol/L和1. 28 x 10-5mo1/L(P <0. OS)，抑制PC-9細(xì)胞生長(zhǎng)的ICS〕分別為2. 13x 1()一“mol/L和4. 58 x 1()一“mol/L。見圖

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　　圖1不同濃度吉非替尼和多西他賽對(duì)A549和PC-9細(xì)胞生長(zhǎng)的影響分別取多西他賽和吉非替尼的ICSc〕作為固定濃度，按上述分組方法研究不同給藥方式下兩藥對(duì)A549和PC -9細(xì)胞的抑制作用。結(jié)果顯示，相比D,G組，DG組對(duì)A549和PC -9細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用均明顯增強(qiáng)(P <0.05)，抑制率分別為60. 0%和57.45%} (D+G)組只對(duì)EGFR突變型的PC -9細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制有增效作用，抑制率為53. 46%，較單藥組明顯增高(P <0.05);在EGFR野生型的A549細(xì)胞中，(D+G)組的抑制率為48. 25 %，與D,G組無明顯差異。而GD組對(duì)A549和PC-9細(xì)胞的抑制率均無明顯的協(xié)同增效作用，抑制率分別為46. 46%和46. 59 0}o。。見表1。)

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　　2. 3多西他賽與吉非替尼不同時(shí)序應(yīng)用對(duì)細(xì)胞EGFR,ERK,AKT, IGF-1 R表達(dá)及其磷酸化的影響單藥多西他賽增強(qiáng)A549和PC-9細(xì)胞EGFR和ERK磷酸化，單藥吉非替尼抑制A549和PC-9細(xì)胞EGFR和ERK磷酸化，多西他賽誘導(dǎo)EGFR和ERK磷酸化被序貫應(yīng)用吉非替尼顯著抑制，但不能被同時(shí)應(yīng)用吉非替尼抑制。吉非替尼抑制EGFR和ERK磷酸化作用不能被應(yīng)用多西他賽逆轉(zhuǎn)。多西他賽與吉非替尼不同時(shí)序應(yīng)用對(duì)A549和PC -9細(xì)胞的AKT及其磷酸化均無明顯影響。單藥多西他賽抑制A549細(xì)胞IG F-1 R表達(dá)及其磷酸化，單藥吉非替尼增強(qiáng)A549細(xì)胞IG F-1 R表達(dá)及其磷酸化。兩藥聯(lián)合對(duì)PC-9細(xì)胞的IG F-1 R表達(dá)無影響，但均抑制IG F-1 R磷酸化。兩藥同時(shí)應(yīng)用對(duì)抑制PC-9的細(xì)胞IGF-1 R磷酸化具增強(qiáng)作用，對(duì)A549細(xì)胞IGF-1R磷酸化無明顯影響。見圖2}

　　2. 4多西他賽與吉非替尼不同應(yīng)用對(duì)細(xì)胞周期的影響對(duì)于A549細(xì)胞，G組未引起明顯的細(xì)胞周期變化，D組可引起明顯的G}期阻滯，由C組的6. 63%上升為49.58%(P<0.05)} DG組有明顯的

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　　圖2吉非替尼和多西他賽同時(shí)及序貫應(yīng)用對(duì)A549和PC-9細(xì)胞信號(hào)蛋白表達(dá)的影響GZ期阻滯，較C組上升約54.11%(P<0.05)}  (D+G)組和GD組各期細(xì)胞無明顯變化。對(duì)于PC -9細(xì)胞，G組可引起明顯的G},/G，期阻滯，G},/G，期細(xì)胞較C組上升29.96%  (P <0. OS) } D組可引起明顯的GZ期阻滯，較C組上升30.13%  (P<0.05)}DG組可見明顯的G:期阻滯，較C組上升40. 77 %(P<0.05)}  (D+G)組和GD組與C組相比，細(xì)胞周期變化不明顯，味/G，期細(xì)胞比例提高13. 27%和17. 10%。見圖3 }

　　3討論

　　本研究結(jié)果顯示，人肺腺癌細(xì)胞A549細(xì)胞為EGFR野生型，K-Ras基因突變型;PC-9細(xì)胞為EG-FR突變型，K-Ras基因野生型。細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)顯示A549和PC-9細(xì)胞分別為吉非替尼耐藥型和敏感型，其ICSc〕分)I為1. 28 x 1()一5 mol/L和4. 58 X 1()一smol/L，對(duì)吉非替尼的敏感性相差1000倍，結(jié)果與既往報(bào)道的一致[‘3141?；谂R床研究顯示化療與EG-FR-TKIs同時(shí)或序貫應(yīng)用可能存在“優(yōu)勢(shì)人群”，而這種“優(yōu)勢(shì)人群”可能源于EGFR突變狀況，我們同時(shí)選用EGFR野生型的A549細(xì)胞和EGFR突變型

　　~~~~~

　　的PC-9細(xì)胞進(jìn)行研究并從細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)蛋自和細(xì)胞周期對(duì)其可能的細(xì)胞學(xué)機(jī)制進(jìn)行探討。

　　Cappuzzo等} ISO報(bào)道的SATURN研究發(fā)現(xiàn)化療聯(lián)合EGFR-TKI增效作用與用藥順序相關(guān)，先化療再序貫EGFR-TKI能夠提高有效率，延長(zhǎng)無疾病進(jìn)展期及肺腺癌患者總生存。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不論是EGFR野生型的A549細(xì)胞還是EGFR突變型的PC -9細(xì)胞，多西他賽序貫吉非替尼對(duì)這兩株人肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用都較單藥多西他賽明顯增強(qiáng)，兩株細(xì)胞間無明顯差別，結(jié)果說明EGFR突變不

　　是化療后序貫EGFR-TKI優(yōu)勢(shì)受益人群，與既往的研究一致。(Ciovannetti等[‘6es在細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上探討化療藥物與吉非替尼以不同順序作用于肺癌細(xì)胞的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不論肺癌細(xì)胞是否存在EGFR突變，應(yīng)用化療藥物后，只有細(xì)胞EGFR磷酸化(pEG-FR)水平增加者才能從后續(xù)的吉非替尼治療中獲益，而與EGFR是否存在突變或擴(kuò)增無關(guān)。新近的INFORM研究亦發(fā)現(xiàn)化療后吉非替尼維持治療晚期NSCLC患者EGFR突變者無進(jìn)展生存期(PFS)的獲益zui大[‘7es。Mok等psl報(bào)道在非選擇人群中比較吉西他濱聯(lián)合鉑類+厄洛替尼與單純吉西他濱聯(lián)合鉑類化療療效的11期研究(FAST-ACT，發(fā)現(xiàn)化療序貫EGFR-TKI能顯著延長(zhǎng)PFS(29.4周。.23. 4周，P = 0. 002。是否延長(zhǎng)總生存日前正在進(jìn)行一項(xiàng)111期臨床試驗(yàn)( FAST-ACT II)加以證實(shí)。

　　本研究?jī)伤幫瑫r(shí)應(yīng)用僅對(duì)EGFR突變型的PC-9細(xì)胞生長(zhǎng)抑制有增效作用，對(duì)EGFR野生型的A549細(xì)胞無增效作用，與既往的研究結(jié)果一致[9，‘6es。雖然有研究顯示化療與EGFR-TKI同時(shí)應(yīng)用，其增效與否與EGFR突變狀況有關(guān)，但日前臨床研究的結(jié)果尚存爭(zhēng)議。TRIBUTE研究對(duì)患者組織學(xué)標(biāo)本進(jìn)行EGFR 18一21和K-Ras基因進(jìn)行突變

　　檢測(cè)，結(jié)果提示，EGFR突變的患者化療聯(lián)合厄洛替尼有效率顯著高于野生型(53 %  vs. 18 % , P =0. 012，但缺少與單藥厄洛替尼的對(duì)比。INTACT試驗(yàn)對(duì)比了EGFR突變型與野生型患者聯(lián)合應(yīng)用化療和吉非替尼的療效，結(jié)果顯示不論在有效率還是總生存方面，兩組患者均無明顯差異，因此認(rèn)為僅憑EGFR突變與否預(yù)測(cè)化療聯(lián)合EGFR-TKI同時(shí)治療的有效率是不夠的[23es。

　　EGFR-TKI通過競(jìng)爭(zhēng)性與EGFR結(jié)合，阻斷其酪氨酸的自身磷酸化及酪氨酸激酶活化，主要通過抑制PI3 K-AKT和MARK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、加速細(xì)胞凋亡、抑制血管生成和抑制浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移?；熉?lián)合EGFR-TKIs增效與否的細(xì)胞學(xué)機(jī)制不明，既往研究顯示化療同時(shí)應(yīng)用EGFR-TKIs不增效的發(fā)生機(jī)制可能與細(xì)胞周期有關(guān)[,H }化療后序貫應(yīng)用EGFR-TKIs產(chǎn)生協(xié)同增效作用可能與EGFR磷酸化有關(guān)[‘6es。

　　本研究發(fā)現(xiàn)，不論A549細(xì)胞還是PC-9細(xì)胞，多西他賽增強(qiáng)EGFR和ERK磷酸化，而吉非替尼呈抑制作用。先用多西他賽后序貫吉非替尼的EGFR和ERK磷酸化水平明顯較多西他賽與吉非替尼同時(shí)應(yīng)用或單獨(dú)應(yīng)用多西他賽降低，這種EGFR和ERK磷酸化水平的變化不伴有EGFR和ERK的增加，這一結(jié)果與我們先前在另一EGFR野生型的SPC-1 A細(xì)胞發(fā)現(xiàn)的一致[‘ges，說明化療上調(diào)EGFR和 ERK磷酸化，使吉非替尼抑制EGFR及ERK敏感性增強(qiáng)，這是化療序貫吉非替尼的協(xié)同增效作用的細(xì)胞學(xué)機(jī)制之一。Van Schaeybroeck}20}和Giovan-netti} }}}報(bào)道，化療與EGFR-TKI聯(lián)合應(yīng)用于不同的NSCLC細(xì)胞，只有細(xì)胞EGFR磷酸化(p-EGFR)水平增加者才能從后續(xù)的吉非替尼治療中獲益，而與EGFR是否存在突變或擴(kuò)增無關(guān)。此外，細(xì)胞周期

　　顯示，多西他賽將兩株細(xì)胞阻滯在Gz期，已知細(xì)胞在Gz/M期開始DNA損傷的修復(fù)和分裂。因此，多西他賽序貫吉非替尼組使Gz/M期細(xì)胞顯著增多，無法從影響細(xì)胞周期來解釋這一協(xié)同作用現(xiàn)象，結(jié)果與既往的研究一致[} 14-I S }v

　　同時(shí)應(yīng)用多西他賽與吉非替尼對(duì)EGFR野生型的A549細(xì)胞無增效作用。吉非替尼抑制A549細(xì)胞EGFR和ERK磷酸化不能被同時(shí)應(yīng)用的多西他賽逆轉(zhuǎn)，這一結(jié)果與我們先前在另一EGFR野生型的人肺腺癌SPC-A1細(xì)胞結(jié)果一致[191，說明多西他賽未增強(qiáng)吉非替尼抑制細(xì)胞生長(zhǎng)作用可能與EGFR和ERK磷酸化水平低下有關(guān)。Van Schaeybroeck等}zo}報(bào)道在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，下調(diào)EGFR磷酸化水平能導(dǎo)致EG FR-TKI與細(xì)胞毒化療藥物產(chǎn)生拮抗作用。

　　同時(shí)應(yīng)用多西他賽與吉非替尼對(duì)EGFR突變型的PC-9細(xì)胞生長(zhǎng)抑制有增效作用。吉非替尼抑制PC -9細(xì)胞EGFR和ERK磷酸化亦不能被同時(shí)應(yīng)用的多西他賽逆轉(zhuǎn)，因此，EGFR和ERK磷酸化不是其增效機(jī)制。既往研究顯示，IGF-1 R表達(dá)與細(xì)胞對(duì)化療及EG FR-TKI、敏感性相關(guān)[21-221，干擾細(xì)胞IGF-1R表達(dá)或IGF-1 R抑制劑可以提高NSCLC細(xì)胞對(duì)化療藥物及EG FR-TKIs的敏感性，化療藥物如多西他賽誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制亦包括了對(duì)IGF-1 R的抑制，增加化療藥物敏感性與抑制PI3 K/AKT關(guān)系密切[lol。反之，EG FR-TKI、影響IGF-1 R表達(dá)[zz }本研究?jī)芍攴蜗侔┘?xì)胞均表達(dá)IGF-1 R,多西他賽與吉非替尼均抑制PC-9細(xì)胞IGF-1 R磷酸化表達(dá)。與單藥多西他賽或吉非替尼比，兩藥同時(shí)應(yīng)用對(duì)PC -9的細(xì)胞IGF-1 R磷酸化抑制有增強(qiáng)作用，但對(duì)A549細(xì)胞IGF-1 R磷酸化無明顯影響。結(jié)果提示同時(shí)用藥對(duì)EGFR突變的PC -9細(xì)胞有增效作用，可能與其增強(qiáng)對(duì)IGF-1 R磷酸化抑制作用有關(guān)，日前我們正進(jìn)行上調(diào)或沉默IG F-1 R觀察同時(shí)用藥對(duì)EGFR突變的PC-9細(xì)胞是否具增效作用加以證實(shí)。

　　本研究應(yīng)用吉非替尼序貫多西他賽對(duì)抑制A549細(xì)胞和PC -9細(xì)胞生長(zhǎng)，均未產(chǎn)生增效作用，鑒于吉非替尼抑制EGFR和ERK磷酸化作用亦不能被序貫應(yīng)用的多西他賽逆轉(zhuǎn)，用EGFR和ERK磷酸化變化無法解釋這一現(xiàn)象。細(xì)胞周期結(jié)果顯示，吉

　　非替尼序貫多西他賽使GZ/M期細(xì)胞顯著減少，而G},/G，期細(xì)胞顯著增多，細(xì)胞周期阻斷在G},/G, ,即進(jìn)人生長(zhǎng)增殖期(S , Gz/M期)的細(xì)胞數(shù)量明顯減

　　少，減弱了多西他賽的細(xì)胞毒作用，所以當(dāng)吉非替尼序貫多西他賽或者與多西他賽同時(shí)作用時(shí)，二者無增效作用，這一結(jié)果可以用細(xì)胞周期變化來解釋，與既往的報(bào)道一致[7A}v

　　多西他賽與吉非替尼不同時(shí)序應(yīng)用對(duì)A549和PC一細(xì)胞AKT及其磷酸化均無明顯影響，說明E G-FR受體細(xì)胞內(nèi)信號(hào)蛋自AKT及其磷酸化不是化療聯(lián)合EGFR-TKIs對(duì)NSCLC細(xì)胞生長(zhǎng)影響的細(xì)胞學(xué)機(jī)制。

本研究的初步結(jié)果顯示，多西他賽與吉非替尼同時(shí)應(yīng)用只對(duì)EGFR突變型的PC -9細(xì)胞具增效作用，但多西他賽序貫吉非替尼的增效作用與EGFR突變狀況無關(guān)。值得注意的是，本研究?jī)H觀察了一種EGFR突變型細(xì)胞，有待在不同EGFR突變型NSCLC細(xì)胞加以證實(shí)，EGFR突變是否可以作為化療聯(lián)合EGFR-TKI的優(yōu)勢(shì)受益人群，尚需前瞻性的多中心隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)加以證實(shí)。)