細胞培養(yǎng)液

細胞培養(yǎng)液簡介

　　雖然細胞培養(yǎng)的實驗早在19世紀末就開始了，但用于培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)液主要是動物的血清或淋巴液。被人稱為細胞培養(yǎng)之父的Ross Harrison就是利用青蛙的淋巴液來培養(yǎng)神經(jīng)細胞的。這樣的培養(yǎng)液不但性質(zhì)不穩(wěn)定，而且只能進行非常小規(guī)模的細胞培養(yǎng)。

　　*個人工配制的培養(yǎng)液是由Lewis & Lewis在1911年由海水、血清、胚胎提取物和鹽和蛋白胨為原料配制成的。但是人們對于培養(yǎng)液中的化學成分并不清楚。直到1948年，Fisher才研制成了*個化學成分清楚的細胞培養(yǎng)液CMRL1006。

　　實驗室常用的細胞培養(yǎng)液的主要成分是氨基酸、葡萄糖、無機鹽、維生素和微量元素等。為了維持穩(wěn)定的pH，培養(yǎng)液中一般有一個pH緩沖系統(tǒng)，同時常加入少量的酚紅作為pH指示劑。另外培養(yǎng)液中一般需要加入一定量的血清。

　　培養(yǎng)液中的氨基酸除了13種細胞生長所必須的氨基酸外，往往加入一些非必需的氨基酸以促進細胞的生長。在必需的氨基酸中，L-谷氨酰胺在溶液中不穩(wěn)定（在4℃培養(yǎng)溶液中半衰期為3個星期，37℃中為1個星期），需要在使用時加入。

　　葡萄糖在培養(yǎng)液中的含量一般為1g/L（低糖）或4.5g/L（高糖）。它是細胞代謝重要的能量來源。

　　細胞培養(yǎng)液中都有一個平衡鹽系統(tǒng)，用于維持細胞的滲透壓、維持pH和細胞正常的代謝等。zui常用的平衡鹽系統(tǒng)有Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS); Earle's balanced salts (EBSS) 和 Hanks' balanced salts (HBSS)。它們都含有細胞所必需的5種離子：鈉離子、鉀離子、鈣離子、鎂離子和磷酸根。培養(yǎng)液中的pH緩沖系統(tǒng)一般是碳酸氫鈉和HEPES等。

　　培養(yǎng)液中的維生素包括葉酸、維生素B、煙酰胺和吡哆醇等。培養(yǎng)液中的微量元素元素包括Cu2+ ，Zn2+ ，和Mn2+等。

　　血清中含有生長因子、促進細胞帖壁的因子、礦物質(zhì)、激素、脂類等，另外血清可以抑制胰酶的活性。

　　一般培養(yǎng)液都含酚紅作為pH指示劑，它是細胞培養(yǎng)液狀態(tài)的一個很好的標志。過長時間的培養(yǎng)或者微生物的污染都會使培養(yǎng)液的pH發(fā)生改變。需要注意的是，酚紅可以模擬類固醇激素（尤其是雌性激素）的作用，所以如果培養(yǎng)的細胞對雌性激素敏感（比如實驗本身就是研究雌性激素對細胞的作用），就應當使用沒有酚紅的培養(yǎng)液。

血清到底需不需要加熱滅活？

　　人們通常通過在56°C加熱30分鐘的辦法，來滅活血清中的補體，以及其中可能的微生物（比如支原體）的污染。加熱滅活帶來的問題是，血清中的氨基酸、維生素和生長因子等也會不同程度的被破壞。

　　Triglia and Linscott的研究發(fā)現(xiàn)（1），胎牛血清中的補體含量很低，即使在未稀釋的胎牛血清中，也觀察不到溶血現(xiàn)象。另外37°C的加熱能夠有效滅活補體。所以對胎牛血清而言，并不需要通過專門的熱滅活來滅活其中的補體。

　　早期的血清制備中的濾膜的孔徑大于0.22um，不能有效的去除支原體的污染。熱滅活可以去除支原體的污染。但是現(xiàn)在血清制備中的終端濾膜的孔徑為0.1um甚至小到0.04um，所以血清中一般沒有支原體的污染。

　　綜合上面的觀點，除非有特別的情況，標準廠家生產(chǎn)的胎牛血清一般不需要加熱滅活。

1) Triglia, R.P., Linscott, W.D. 1980. Titers of nine complement components, conglutinin and C3b inactivator in adult and fetal bovine sera. Molecular Immunology. 17:741-748.

選用血清時要注意什么？

　　細胞培養(yǎng)使用的一般是胎牛血清。由于胎牛血清價格非常貴，為了節(jié)約，對于一些比較容易生長的細胞，有時候也使用新生牛血清，或者馬血清。

　　血清中含有血清清蛋白、生長因子等。對于大多數(shù)培養(yǎng)的動物細胞而言，培養(yǎng)液中加入血清是生長必須的。雖然無血清培養(yǎng)液已經(jīng)出現(xiàn)，但無血清培養(yǎng)液只適用于特定的細胞，而且價格一般比較昂貴，所以在比較長的時間內(nèi)，細胞培養(yǎng)仍然需要血清。

　　對于一種特定的細胞，可以從ATCC（American Type Culture Collection）查到培養(yǎng)液中需要加入的血清的種類和濃度。

　　來自不同商家的血清差異很大，即使來自同一商家的血清，不同批次之間仍然會有非常大的差異。對于培養(yǎng)不易生長的細胞而言，挑選的血清非常重要。一般來說，可以向血清生產(chǎn)商家索取少量不同批次的血清，經(jīng)過試驗后找到對細胞生長zui有利的批次，然后大量購買該批次的血清，儲存于-80度的冰箱內(nèi)，供長期使用。