1、cell counting:盡量做到準(zhǔn)確,會影響input結(jié)果。
2、cross link:甲醛的終濃度是1%,這個基本所有的protocol上都會強調(diào)。
3、resuspend cellswith SDS:一定要選用小的tip頭,在液面下吹打,否則很容易產(chǎn)生氣泡,后面的sonication就麻煩了。
4、sonication:ChIP中zui重要的一部分,合適的條件要自己摸索,可以一次嘗試不同次數(shù)的sonication,然后建議采用EZ-ChIP上推薦的方法看看sonication的效果如何。
5、加入salmon spermDNA/Protein A or G之前要先混勻,因為salmon sperm DNA是很粘稠的物質(zhì),若不混勻,后面你會發(fā)現(xiàn)beads的量不一樣,自然也會影響實驗的結(jié)果。
6、wash 的時候前面幾個步驟可以不用洗的太干凈,但zui后一個要盡量吸干凈,必要時可用gel loading tips吸。
7、含beads的samples離心時,有的protocol上推薦是1000rpm,45秒,但可以根據(jù)情況調(diào)整,但要注意轉(zhuǎn)速不能太快防止beads破碎。(當(dāng)然如果采用的是magnetic的beads就不存在這個問題)
8、reverse crosslink可以是65°4個小時,也可以overnight。
9、reverse crosslink后的在進行下面步驟之前建議先離心,把蒸發(fā)到離心管蓋子上的部分離下來。
10、每次行real time PCR之前都要把sample離心保證取樣的準(zhǔn)確。
11、1~10ul的槍取3ul以上才比較準(zhǔn)確,所以考慮好自己PCR反應(yīng)體系的配置。
12、一個ChIP一般需要3~4天的時間,其中有幾個步驟是可以停下來的:
(1)細胞收集:用含蛋白酶抑制劑的PBS洗滌離心,去上清的細胞收集液可置-80°凍存;
(2)用SDS重懸細胞后可置-80°凍存;
(3)sonication結(jié)束,離心后的上清置新的離心管后可-80°凍存;
(4)reverse cross-link后的標(biāo)本可-80°凍存。
13、agarose beads 的wash過程中以及后面的DNA提取過程中乙醇的wash,可以用細胞室的那種吸引器,接上200ul的tip頭吸,這樣會節(jié)省很多時間(每個實驗室情況可能不一樣)。
14、DNA提取后建議用水溶解DNA,因為TE buffer里的EDTA可能會影響PCR反應(yīng)體系中的Mg2+。
15、溶解DNA的水量可以根據(jù)PCR反應(yīng)體系的要求適當(dāng)調(diào)整。
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