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生物分子類實驗室常用實驗技術原理匯總-5

來源:廣州譽維生物科技儀器有限公司   2014年12月09日 10:12  

十一、BCA法測蛋白質濃度

十二、大腸桿菌感受態細胞(E.coli DH5α)制備

1、前夜接種受體菌(DH5?或DH10B),挑取單菌落于LB培養基中37℃搖床培養到第二日(約16小時);

2、取1ml已培養到第二日的培養物轉接于100ml LB培養基中,在37℃搖床上劇烈振蕩培養約2.5-3小時(250-300rpm);

3、將0.1M CaCl2溶液置于冰上預冷;以下步驟需在超凈工作臺和冰上操作;

4、吸取1.5ml培養好的菌液至1.5ml離心管中,在冰上冷卻10分鐘;

5、4℃下3000 g冷凍離心5分鐘;

6、棄去上清,加入100微升預冷0.1M CaCl2溶液,用移液槍輕輕上下吸動打勻,使細胞重新懸浮,在冰放置20分鐘;

7 、4℃下3000 g冷凍離心5分鐘;

8 棄去上清,加入100微升預冷0.1M CaCl2溶液,用移液槍輕輕上下吸動打勻,使細胞重新懸浮;

9 細胞懸浮液可立即用于轉化實驗或添加冷凍保護劑(15% - 20%甘油)后超低溫冷凍貯存備用(-70℃)。

十三、堿變性提取質粒DNA

堿變性提取質粒DNA是基于染色體DNA與質粒DNA的變性與復性的差異而達到分離目的。在pH高達12.6的堿性條件下,染色體DNA的氫鍵斷裂,雙螺旋結構解開而變性。質粒DNA的大部分氫鍵也斷裂,但超螺旋共價閉合環狀的兩條互補鏈不會*分離,當以pH4.8的NaAc高鹽緩沖液去調節其pH至中性時,變性的質粒DNA又恢復原來的構型,保存在溶液中,而染色體DNA不能復性而形成纏連的網狀結構,通過離心,染色體DNA與不穩定的大分子RNA、蛋白質-SDS復合物等一起沉淀下來而被除去

十四、目的基因的連接、轉化及克隆篩選

(1)總過程:

分---PCR分離目的基因

切---限制性內切酶切割

接---目的基因與載體相連

轉---轉入宿主細胞

篩---篩選陽性重組體

(2)分---PCR分離目的基因:PCR克隆、同源克隆、文庫篩選

(3)切---限制性內切酶切割:粘性末端、平末端

(4)接---目的基因與載體相連

原 理:利用DNA聚合酶反應時都有在PCR產物的3’末端添加一個或者幾個A堿基的特性和利用T載體3’末端的T堿基和PCR產物的A堿基互補配對,經連接酶作用,完成與載體的連接。

(5)轉---轉入宿主細胞

感受態細胞:經過電擊、 CaCl2、 RuCl等化學試劑處理后,細胞膜的通透性發生變化,成為能容許外源 DNA 分子通過時細胞的狀態。

(6)篩---篩選陽性重組體

十五、RNA干擾(RNAi)

一些小的雙鏈RNA(siRNA)可以通過促使特定基因的mRNA降解來、特異的阻斷體內特定基因表達,誘使細胞表現出特定基因缺失的表型,稱為RNA干擾(RNAi)。

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