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生物分子類實(shí)驗(yàn)室常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)原理匯總-4
九、RT-PCR
RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增合成目的片段。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進(jìn)行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在*條件下進(jìn)行。
實(shí)驗(yàn)步驟：
1、RNA的提取；
2、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；
3、PCR擴(kuò)增；
4、產(chǎn)物的電泳和結(jié)果的測(cè)定。
十、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Q—PCR）（Real-time Quantitative PCR ）
利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析。
閾值：是循環(huán)開(kāi)始3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，設(shè)定在擴(kuò)增曲線指數(shù)增長(zhǎng)期。
C(t)值：熒光信號(hào)（擴(kuò)增產(chǎn)物）到達(dá)閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。
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