1. 掌握比色分析法和分光光度法基本原理、標準曲線的制作及使用,標準管法結果計算
2. 熟悉蛋白質含量測定常用方法、原理及應用
3. 了解常用可見光、紫外分光光度計的測定原理及使用
【教學內容】
1. 酚試劑法蛋白質含量測定
Lambert-Beer定律,比色分析法和分光光度法基本原理, 722型分光光度計使用,常用蛋白質含量測定方法及應用,酚試劑法測定蛋白質含量原理、操作, 標準曲線的制備及使用
2. 雙縮脲法蛋白質含量測定
自學和獨立完成實驗并與酚試劑法比較,結果計算
3. 紫外分光光度法蛋白質含量測定
紫外分光光度法測定蛋白質含量原理,方法,優缺點,注意事項;國產752型紫外分光光度計使用,UV—260分光光度計使用,注意事項,波長掃描,標準曲線制作
【實驗原理】
一、比色分析法
許多物質本身具有一定的顏色,也有許多物質本身無顏色,在加入適當的顯色劑后生成有色物質。溶液濃度越大,顏色越深。因此可以利用比較溶液顏色深淺的方法來測定有色溶液的濃度。這種方法叫比色分析法。
比色分析法和分光光度法測定蛋白質含量
←光的互補示意圖
1. 物質的顏色和波長:
可見光:波長(λ)400—760nm
紫外光:λ小于400nm
紅外光:λ大于760nm
光的互補:將兩種適當顏色的可見光按一定強度比例混合可得到白光,這兩種光叫互補光,該現象叫光的互補。
單色光:白光通過棱鏡后可分解成各種波長不同的色光,把具有一種波長,不能再分解的光叫單色光。
2. 溶液的顏色和光吸收的關系:
溶液的顏色,是由于不同的有色物質有選擇地吸收某種顏色的光而引起的。溶液呈現的顏色是與它主要吸收的光相互補的光的顏色。溶液吸收的光越多,呈現的顏色越深。
例如:一束白光通過核黃素溶液,溶液呈黃色,是因為藍色光被吸收,而其它顏色的光均為兩兩互補,透過光只多余出黃色光,所以核黃素溶液呈黃色。
光吸收曲線:測定同一物質對不同波長光線的吸收程度,以波長為橫坐標,光密度為縱坐標作圖,所得曲線為光吸收曲線。
3. 物質濃度,液層厚度與光吸收的關系(Lambert--Beer定律):
當一束單色光通過溶液后,光被溶液吸收的程度(D)與溶液的濃度(C),液層的厚(L)以及入射光的強度(I0)有關。溶液濃度越大,液層越厚,吸光越多,這就是物質(均勻透明固體,液體,氣體)對光的吸收定律。
lg I0 / I 意義:
當I = I0 時,lg I0 / I=0,表示溶液*不吸收光線;
當I<I0時,lg I0 / I值較大,表示溶液對光吸收較多;
當I→0 時,lg I0 / I值無窮大,表示光線幾乎被溶液*吸收(溶液不透光)。
由此可見,lg I0 / I表示了溶液對光的吸收程度。
表示方法: 光密度OD或D(opticaldensity)
吸光度A(Absorbance)
消光度E(Extinction)
于是,(3)式可寫成:D = KCL
公式中K為消光系數,K = D/CL,表示有色溶液在單位濃度和單位厚度時的吸光度。
同一溶質,K值相同。
百分消光系數:C = 1%,L = 1cm
克分子消光系數:C = 1克分子濃度,L=1cm
D=KCL意義:物質對光吸收程度與該物質的消光系數K,溶液濃度C,液層厚度L成正比。
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