牛偽狂犬病毒（PRV）定性檢測試劑盒（ELISA）

使用說明書

【試劑盒名稱】

牛偽狂犬病毒（PRV）定性檢測試劑盒（ELISA）

【試劑盒用途】

定性檢測牛血清、血漿及相關液體樣本中偽狂犬病毒（PRV）。

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【檢測原理】

本試劑盒采用雙抗體一步夾心酶聯免疫吸附法（ELISA）。將陰性對照、陽性對照、待測樣本和酶標工作液加入到預先包被牛偽狂犬病毒（PRV）抗體的透明酶標包被板中，溫育足夠時間后，洗滌除去未結合的成分。依次加入顯色劑A、B液，顯色劑（TMB）在辣根過氧化物酶（HRP）催化下轉化為藍色產物，在酸的作用下變成黃色，顏色的深淺與樣品中牛偽狂犬病毒（PRV）濃度呈正相關，450nm波長下測定OD值，根據陰性對照、陽性對照和樣品的OD值，判斷樣本中是否含有牛偽狂犬病毒（PRV）。

【試劑盒組成】

【需要而未提供的試劑和器材】

1、37℃恒溫箱

1. 標準規格酶標儀
2. 精密移液器及一次性吸頭
3. 蒸餾水
4. 一次性試管
5. 吸水紙

【操作步驟】

1、準備：從冰箱取出試劑盒，室溫復溫平衡30分鐘。

2、配液：用蒸餾水將20倍濃縮洗滌液稀釋成原倍的洗滌液。

3、加對照品和待測樣本：取足夠數量的酶標包被板，固定于框架上，分別設置陽性對照孔、陰性對照孔、待測樣本孔和空白對照孔，記錄各孔位置，在對照品孔中加入陽性對照品和陰性對照品各50μL；待測樣本孔中先加入待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL（即樣本稀釋5倍）；每孔再加入酶標工作液100μL；空白對照孔不加。

4、溫育：37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5、洗板：棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機按說明書操作洗板）。

6、顯色：每孔先加入顯色劑A 液50μL，再加入顯色劑B液 50μL，37℃避光顯色15min。

7、終止：取出酶標板，每孔加終止液50μL，終止反應（顏色由藍色立轉黃色）。

8、測定：以空白孔調零，在終止后15分鐘內，用450nm波長測量各孔的吸光值（OD值）。

【樣本要求】

1、樣本不能含疊氮鈉（NaN₃），因為疊氮鈉（NaN₃）是辣根過氧化物酶（HRP）的抑制劑。

2、標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能立即試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融。

3、樣本應充分離心，不得有溶血及顆粒。

【注意事項】

1、實驗嚴格按照說明書的操作進行，實驗結果判定必須以酶標儀讀數為準。

2、酶標包被板開封后如未用完，應立即裝入密封袋中加干燥劑保存。

3、建議所有的標準品、樣本和空白對照都做雙份檢測，取平均值，以減小實驗誤差。

4、若顯色過淺，可適當延長底物溫育時間。

5、為避免交叉污染，標準品、樣本和空白對照每加一個就要更換一次吸頭；酶標工作液、樣本稀釋液和底物等公共組分，要懸臂加樣，不得碰到微孔；不得重復使用封板膜。

6、試劑盒保質期內使用，不同批號的試劑不得混用。

7、底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。

【結果判斷】

1 試驗有效性：陽性對照孔OD值平均值≥1.00；

                陰性對照孔OD值平均值≤0.15。

2 臨界值（Cut off）計算：臨界值=陰性對照孔平均值+0.15

3 陰性判斷：樣品OD值＜臨界值（Cut off），樣品為陰性

4 陽性判斷：樣品OD值＞臨界值（Cut off），樣品為陽性

【操作程序總結】

準備試劑，樣品和對照品

加入準備好的樣品、對照品品和酶標工作液，37℃反應60分鐘

洗板5次，加入顯色液A、B，37℃顯色15分鐘

加入終止液

15分鐘之內讀OD值

計算

【規格】

96人份/盒

【貯藏】

2-8℃，避光防潮保存。

【有效期】

6個月

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