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Biocoat 血管生成系統(tǒng):內(nèi)皮細胞侵襲

來源:北京博蕾德生物科技有限公司   2014年03月26日 16:51  

Biocoat 血管生成系統(tǒng):內(nèi)皮細胞侵襲

BD 產(chǎn)品貨號354141354145354146

儲存和運輸-20度儲存,干冰運輸。

操作指南:

血管生成過程中,內(nèi)皮細胞活化后表達基質(zhì)蛋白酶(MMPs),可降解血管基底膜。BD Biocoat 內(nèi)皮細胞侵襲系統(tǒng)提供了抗/促血管再生化合物的體外定量實驗?zāi)P汀?nèi)皮細胞侵襲系統(tǒng)包括:BD Falcon24多孔培養(yǎng)小室,含配套接收板和蓋子;BD fluoroBlok熒光屏蔽3.0μm孔徑PET膜,預(yù)包被Matrigel基質(zhì),具體操作步驟如下:

1 凍融

1.1 -20冰箱中取出包裝,使其自然升溫到室溫。

1.2 在小室內(nèi)加入0.5ml37℃預(yù)熱的基本培養(yǎng)基,在37CO2環(huán)境下凍融15-45分鐘,待用。

1.3 凍融后,小心去去除培養(yǎng)基,避免破壞Matrigel基質(zhì)膜。可用抽吸或倒置培養(yǎng)板并輕拍的方法去除培養(yǎng)基。

2 侵襲實驗:用BD鈣黃綠素Calcein AM熒光染色劑后標記

細胞侵襲基質(zhì)膜穿過熒光標記膜后,采用熒光標記定量。

2.1 采用如1.1的步驟凍融,對照板無需凍融。

2.2 胰酶酶解細胞單層,使其懸浮在無血清培養(yǎng)基中,濃度為2.0×105/mL。*的接種細胞濃度需要采用一系列細胞濃度進行優(yōu)化,包括在下室培養(yǎng)表面的濃度(例如,培養(yǎng)瓶,培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板)。例如,接種濃度為105cell/cm2時,采用濃度為0.5×105到5.0×105 cell/cm2的范圍確定*的接種濃度。

2.3 在上小室中加入0.25mL的細胞懸浮液(5.0×104 cell/well)。

2.4 通過進樣口,快速加入750μl5%FBS或適量生長因子(比如BDVEGF)的培養(yǎng)基,作為底部小室的化學誘導(dǎo)劑。

2.5 小室和對照小室在375%CO2環(huán)境下培養(yǎng)22±1小時。

3、細胞侵襲能力的測定:用BD鈣黃綠素Calcein AM熒光染色劑后標記定量

注意:對于每一個完成得培養(yǎng)板,需要12.5mLHBSS50μg的鈣黃綠素。HBSS的使用時為了減少熒光染色劑自動水解引起的高背景熒光。

3.1 準備濃度為4μg/mLd 高黃綠素。12.5mLHBSS37℃預(yù)熱。50μg高黃綠素用20μLDMSO溶解,加入150μL預(yù)熱的HBSS。將其轉(zhuǎn)入大量的HBSS中,用150μL預(yù)熱的HBSS清洗熒光染料的容器。

3.2 孵育后,小心去除上小室中的培養(yǎng)基。注意小心轉(zhuǎn)移鄰近小室底部的培養(yǎng)基。可以通知抓住培養(yǎng)板,輕輕拍打,使培養(yǎng)基從下部滴落。避免破壞Matrigel基質(zhì)膜。

3.3 將培養(yǎng)小室轉(zhuǎn)移到另一塊24孔板中,該孔板含有0.5mL每孔的4μg/mL鈣黃綠素。在375%CO2環(huán)境下孵育90分鐘。

3.4 侵襲小室的熒光定量信息通過熒光板讀板機底部讀數(shù)取得,激發(fā)波長494nm,發(fā)射波長517nm。只有侵襲并通過Matrigel FluoroBlokTM膜后細胞才能被檢測。

注意:后標記所使用的染色劑不局限于胞核染色,比如SYTO-24,在血清培養(yǎng)基環(huán)境中具有較低背景,不需要使用第二塊板用于標記。

4、侵襲研究:DilC123)熒光染色劑預(yù)標記法

細胞接種于孔板之前先用于染色劑標記,可用于均一化實驗,所得到的實時動力曲線可揭示細胞通過基底膜侵襲的能力,不需要分解和破壞各個時間點。

4.1 1.1所示凍融。

4.2 不同濃度的各類熒光素對細胞標記的程度不同,標記濃度和時間,接種細胞濃度和化學誘導(dǎo)劑必須先優(yōu)化。

4.3 胰酶消化細胞單層,制備細胞懸液,溶于無血清DMEM培養(yǎng)基,濃度為2×105cell/mL。*的接種細胞濃度需要采用一系列細胞濃度進行優(yōu)化,包括在下室培養(yǎng)表面的濃度(例如,培養(yǎng)瓶,培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板)。例如,接種濃度為105cell/cm2時,采用濃度為0.5×1055×105 cell/cm2的范圍確定*的接種濃度。

4.4 在上小室中加入0.25mL的細胞懸液(5.0×104cell/小室)。

4.5 通過進樣口,快速加入750μL含有5%FBS或適量生長因子(如BD VEGF)的培養(yǎng)基,作為下室的誘導(dǎo)劑。

4.6 小室和對照小室在375%CO2環(huán)境下培養(yǎng)22±1小時。

5、細胞侵襲的計算:用DilC123)熒光染色劑后標記定量

侵襲小室的熒光定量信息通過熒光板讀板機底部讀數(shù)取得,激發(fā)波長549nm,發(fā)射波長565nm。只有侵襲通過Matrigel FluoroBlok膜被標記的細胞才能被檢測。

6、結(jié)果計算

注意:數(shù)據(jù)可以用相對熒光值RFU或侵襲百分比表示,后者在標準化數(shù)據(jù)處理中更有用。

背景扣除:計算平均背景值,將其從各個孔板中扣除。

6.1 侵襲百分比

侵襲百分比%=通過基質(zhì)膜包被的熒光膜侵襲細胞的平均相對熒光值/通過未包被熒光膜侵襲的平均相對熒光值×100

6.2 信噪比

信噪比S/N=實驗組細胞侵襲的相對熒光值/對照組細胞侵襲的相對熒光值

自動化操作注意事項

1 BD Falcon FluoroBlok 24孔板培養(yǎng)小室系統(tǒng)能適用于自動化操作系統(tǒng)。蓋子可以用標準機械手取走,也可用吸力取走。

2 為了避免各孔間污染,孔板設(shè)定為一個統(tǒng)一的方向。為了與培養(yǎng)小室匹配,確保Falcon的商標均在2者上方,面向同一個方向。

3 任何規(guī)格的槍頭都能達到小室的兩邊。包括50μL100μL200μL250μL1000μL

 


 

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