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Biocoat 血管生成系統:內皮細胞侵襲

來源:北京博蕾德生物科技有限公司   2014年03月26日 16:51  

Biocoat 血管生成系統:內皮細胞侵襲

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儲存和運輸-20度儲存,干冰運輸。

操作指南:

血管生成過程中,內皮細胞活化后表達基質蛋白酶(MMPs),可降解血管基底膜。BD Biocoat 內皮細胞侵襲系統提供了抗/促血管再生化合物的體外定量實驗模型。內皮細胞侵襲系統包括:BD Falcon24多孔培養小室,含配套接收板和蓋子;BD fluoroBlok熒光屏蔽3.0μm孔徑PET膜,預包被Matrigel基質,具體操作步驟如下:

1 凍融

1.1 -20冰箱中取出包裝,使其自然升溫到室溫。

1.2 在小室內加入0.5ml37℃預熱的基本培養基,在37CO2環境下凍融15-45分鐘,待用。

1.3 凍融后,小心去去除培養基,避免破壞Matrigel基質膜。可用抽吸或倒置培養板并輕拍的方法去除培養基。

2 侵襲實驗:用BD鈣黃綠素Calcein AM熒光染色劑后標記

細胞侵襲基質膜穿過熒光標記膜后,采用熒光標記定量。

2.1 采用如1.1的步驟凍融,對照板無需凍融。

2.2 胰酶酶解細胞單層,使其懸浮在無血清培養基中,濃度為2.0×105/mL。*的接種細胞濃度需要采用一系列細胞濃度進行優化,包括在下室培養表面的濃度(例如,培養瓶,培養皿和培養板)。例如,接種濃度為105cell/cm2時,采用濃度為0.5×105到5.0×105 cell/cm2的范圍確定*的接種濃度。

2.3 在上小室中加入0.25mL的細胞懸浮液(5.0×104 cell/well)。

2.4 通過進樣口,快速加入750μl5%FBS或適量生長因子(比如BDVEGF)的培養基,作為底部小室的化學誘導劑。

2.5 小室和對照小室在375%CO2環境下培養22±1小時。

3、細胞侵襲能力的測定:用BD鈣黃綠素Calcein AM熒光染色劑后標記定量

注意:對于每一個完成得培養板,需要12.5mLHBSS50μg的鈣黃綠素。HBSS的使用時為了減少熒光染色劑自動水解引起的高背景熒光。

3.1 準備濃度為4μg/mLd 高黃綠素。12.5mLHBSS37℃預熱。50μg高黃綠素用20μLDMSO溶解,加入150μL預熱的HBSS。將其轉入大量的HBSS中,用150μL預熱的HBSS清洗熒光染料的容器。

3.2 孵育后,小心去除上小室中的培養基。注意小心轉移鄰近小室底部的培養基。可以通知抓住培養板,輕輕拍打,使培養基從下部滴落。避免破壞Matrigel基質膜。

3.3 將培養小室轉移到另一塊24孔板中,該孔板含有0.5mL每孔的4μg/mL鈣黃綠素。在375%CO2環境下孵育90分鐘。

3.4 侵襲小室的熒光定量信息通過熒光板讀板機底部讀數取得,激發波長494nm,發射波長517nm。只有侵襲并通過Matrigel FluoroBlokTM膜后細胞才能被檢測。

注意:后標記所使用的染色劑不局限于胞核染色,比如SYTO-24,在血清培養基環境中具有較低背景,不需要使用第二塊板用于標記。

4、侵襲研究:DilC123)熒光染色劑預標記法

細胞接種于孔板之前先用于染色劑標記,可用于均一化實驗,所得到的實時動力曲線可揭示細胞通過基底膜侵襲的能力,不需要分解和破壞各個時間點。

4.1 1.1所示凍融。

4.2 不同濃度的各類熒光素對細胞標記的程度不同,標記濃度和時間,接種細胞濃度和化學誘導劑必須先優化。

4.3 胰酶消化細胞單層,制備細胞懸液,溶于無血清DMEM培養基,濃度為2×105cell/mL。*的接種細胞濃度需要采用一系列細胞濃度進行優化,包括在下室培養表面的濃度(例如,培養瓶,培養皿和培養板)。例如,接種濃度為105cell/cm2時,采用濃度為0.5×1055×105 cell/cm2的范圍確定*的接種濃度。

4.4 在上小室中加入0.25mL的細胞懸液(5.0×104cell/小室)。

4.5 通過進樣口,快速加入750μL含有5%FBS或適量生長因子(如BD VEGF)的培養基,作為下室的誘導劑。

4.6 小室和對照小室在375%CO2環境下培養22±1小時。

5、細胞侵襲的計算:用DilC123)熒光染色劑后標記定量

侵襲小室的熒光定量信息通過熒光板讀板機底部讀數取得,激發波長549nm,發射波長565nm。只有侵襲通過Matrigel FluoroBlok膜被標記的細胞才能被檢測。

6、結果計算

注意:數據可以用相對熒光值RFU或侵襲百分比表示,后者在標準化數據處理中更有用。

背景扣除:計算平均背景值,將其從各個孔板中扣除。

6.1 侵襲百分比

侵襲百分比%=通過基質膜包被的熒光膜侵襲細胞的平均相對熒光值/通過未包被熒光膜侵襲的平均相對熒光值×100

6.2 信噪比

信噪比S/N=實驗組細胞侵襲的相對熒光值/對照組細胞侵襲的相對熒光值

自動化操作注意事項

1 BD Falcon FluoroBlok 24孔板培養小室系統能適用于自動化操作系統。蓋子可以用標準機械手取走,也可用吸力取走。

2 為了避免各孔間污染,孔板設定為一個統一的方向。為了與培養小室匹配,確保Falcon的商標均在2者上方,面向同一個方向。

3 任何規格的槍頭都能達到小室的兩邊。包括50μL100μL200μL250μL1000μL

 


 

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