常用包埋劑選擇指南   

    我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中需要各種各樣的包埋劑：石蠟、樹脂等等，哪種適合自己呢？剛開始進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室的同學(xué)會(huì)有些茫然，這里我向大家推薦一些包埋劑的選擇方法。

   我們就從簡(jiǎn)單的說(shuō)起，根據(jù)自己的研究目標(biāo)物需要切多厚的片子和自己實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)設(shè)備來(lái)決定用電鏡還是光鏡解決問(wèn)題。切記，光鏡即可判定的問(wèn)題就用光鏡，快速且容易掌握，利于問(wèn)題的解決，何樂(lè)而不為呢，節(jié)約時(shí)間和金錢，這才是主要的。光鏡常用什么包埋劑呢，石蠟！石蠟到處都有售賣，經(jīng)濟(jì)又實(shí)惠，普通的切片*的了。但是如果石蠟解決不了我的問(wèn)題，我需要更的研究，或者我的樣本根本不能用石蠟包埋，我需要低溫，我需要染色，我需要電鏡觀察，這怎么辦呢？

    樣本包埋的目的是什么，這是我們思考問(wèn)題的基本出發(fā)點(diǎn)。樣本制備過(guò)程中的滲透和包埋的目的是使包埋劑逐步滲透入組織細(xì)胞內(nèi)，以便與細(xì)胞外的包埋劑同時(shí)聚合，保證能切出質(zhì)量?jī)?yōu)良的超薄切片。光學(xué)顯微鏡觀察的切片一般是用石蠟包埋的，但電子顯微鏡觀察的切片比石蠟切片要薄得多，因此，石蠟不適宜做超薄切片。一般電鏡用的包埋劑應(yīng)具備如下的特點(diǎn)：

硬度適宜而且均一,有良好的切割性能，目前通用的包埋劑切割性能都很好。一般來(lái)說(shuō)，Epon 812和非極性丙烯酸樹脂的切割性能要比低粘度的環(huán)氧樹脂（如Spurr等）以及極性丙烯酸樹脂（如Lowicryl K4M等）好。

能溶于脫水劑或滲透的過(guò)渡試劑，并且有足夠的低粘度，以保證能自由地滲入樣品

對(duì)樣品的傷害不大，聚合前后體積變化不大，環(huán)氧樹脂聚合前后體積變化不大，而丙烯酸樹脂收縮相對(duì)大一些（體積收縮15-20%）。

能經(jīng)受電子束轟擊

透明度好，高倍電鏡下不顯示本身任何微細(xì)結(jié)構(gòu)

毒性低，使用方便，但目前使用的包埋劑在聚合之前都有毒，操作時(shí)要注意。

    根據(jù)上述對(duì)包埋劑的要求，目前在電鏡技術(shù)上使用的包埋劑種類頗多，但普遍使用的是環(huán)氧樹脂，在免疫和細(xì)胞化學(xué)技術(shù)中普遍使用的則是丙烯酸樹脂。

    環(huán)氧樹脂的型號(hào)較多，常用Epon812，Spurr樹脂（ERL-4221）等。環(huán)氧樹脂包埋劑對(duì)細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)有較好的保存性能，聚合后體積縮小較少，而且在真空中能經(jīng)受較長(zhǎng)時(shí)間的轟擊。但它的操作不太方便，反差較弱。

    丙烯酸樹脂無(wú)色透明的，由丙烯酸衍生物聚合而成。丙烯酸單體粘度低，可以在低溫下滲透及聚合，因而能滿足免疫和細(xì)胞化學(xué)技術(shù)低溫操作的要求。其聚合方式有兩種，熱聚合和紫外線照射聚合。但它對(duì)脂類等成分的抽提比環(huán)氧樹脂嚴(yán)重，為此它也需要在較低的溫度下使用才可能減少抽提作用。此外，聚合前后丙烯酸樹脂的體積變化較環(huán)氧樹脂大（體積大約收縮10-20%），并且它在電子束的照射下穩(wěn)定性比環(huán)氧樹脂低，放熱的聚合過(guò)程可引起組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷，致敏性也比環(huán)氧樹脂強(qiáng)，使用時(shí)要小心防護(hù)。一般來(lái)說(shuō)，除了免疫和細(xì)胞化學(xué)技術(shù)外，超微結(jié)構(gòu)的研究并不推薦使用它。在電鏡中使用較多的丙烯酸樹脂有倫敦白膠（LR White）和Lowicryl系列的樹脂以及technovit系列樹脂。

1.冰凍切片包埋劑

    常規(guī)石蠟包埋切片，樣本需要作一系列技術(shù)處理，一般需化費(fèi)24小時(shí)方可完成全部制片過(guò)程。醫(yī)院有時(shí)需要快速切片診斷，快速冰凍切片是目前常用的方法，其中就用到了冰凍切片包埋劑。冰凍切片包埋劑常見的是OCT冰凍切片包埋劑和TBS冰凍切片包埋劑。對(duì)于需要完整包埋較大組織的研究人員來(lái)說(shuō)，TBS包埋劑可能得到更好的切片質(zhì)量。

2.Epon812（Embed 812）包埋劑 

    Epon812（Embed 812）是一種進(jìn)口樹脂，它是一種長(zhǎng)鏈的脂肪族環(huán)氧化合物，是目前上普遍采用的一種優(yōu)良包埋劑，常態(tài)粘度為150-210cP。該包埋劑的配制方法很多，但一般都按1961年Luft提出的配方進(jìn)行。下述配方若改變A液和B液的比例則可調(diào)節(jié)聚合塊硬度，A液多則軟，B液多則硬。A:B=1:1的配方適用普通的應(yīng)用。通常冬天使用A:B=2:8；夏天使用A:B=1:9，可視組織的硬度和氣候不同選擇其比例。配制時(shí)可先分別配制A液和B液，然后將A液和B液按一定比例混合后，再加入1%-2%的加速劑（BDMA需要 2.5-3%，如用 DMP-30僅需 1.5-2%），邊加邊攪拌，使其充分混合。

    有人將EMbed 812，DDSA，MNA三種成分按一定比例直接混合使用。根據(jù)樣品塊的硬度推薦不同的配方，這些知識(shí)產(chǎn)品的說(shuō)明書里面就有。你常見到“根據(jù)南方地區(qū)的氣候條件，可用下列配方”字樣，這說(shuō)明812樹脂包埋時(shí)受到環(huán)境濕度和溫度的影響較大，這會(huì)給我們的實(shí)驗(yàn)會(huì)帶來(lái)一些不確定的因素，習(xí)慣選擇812樹脂做包埋的的一般是些實(shí)驗(yàn)老手，經(jīng)驗(yàn)豐富，掌控力強(qiáng)，新手要多加小心。

3.Spurr（ERL-4221包埋劑）包埋劑

    這是1969年由Spurr推薦使用的包埋劑，所以也稱Spurr樹脂。它含有兩個(gè)環(huán)氧基，是一種低粘度（7-10cP）的環(huán)氧樹脂。由于具有粘度低的特點(diǎn)，所以近年來(lái)一些實(shí)驗(yàn)室已開始使用它。其配方可按表中各種成分的比例，即可獲得不同性能的包埋塊。

    Spurr樹脂硬度可用DER-736的量來(lái)調(diào)節(jié)。配制時(shí)，先把前三種成分混合后，后才加入DMAE，但從開始到混合完成，達(dá)到淡黃色狀態(tài)需3-7天。此包埋劑在70C，一般8小時(shí)即可*聚合，用陳舊的包埋劑時(shí)，則聚合時(shí)間會(huì)減少。因Spurr樹脂嗜氧，聚合時(shí)不要加蓋。包埋劑是用新鮮配制，但為了方便，可預(yù)先配制好保存在低溫和防潮的環(huán)境中。Spurr樹脂與Embed812樹脂相比粘度低，操作方便，新手容易掌握一點(diǎn)，但毒性比Embed 812樹脂大，所以操作時(shí)要更加小心。

4.倫敦白膠（LR White） 

    倫敦白膠含有7種不同的丙烯酸單體和2種增塑劑，引發(fā)劑是BPO（dibenzoyl peroxide），其具體的配方和成分沒(méi)有報(bào)道。它的粘度低，滲透能力強(qiáng)，可用于較大的組織塊或致密的組織，由于它有一定的親水性，方便水性染料進(jìn)入，染色效果佳，使用非常方便。倫敦白膠可以微溶于水，因而可以采用部分脫水方案，但不能使用丙酮作為脫水劑。氧氣會(huì)抑制聚合反應(yīng)的進(jìn)行，因而聚合時(shí)要在模塊中注滿包埋劑并蓋緊蓋子。此外，倫敦白膠不能在-15C以下的溫度使用。為了方便運(yùn)輸和儲(chǔ)存，通常出售未加BPO的中等硬度的倫敦白膠（uncatalysed LR White），這種試劑買回需要自己加入催化劑（9.9g催化劑/500gLR White）充分?jǐn)嚢璨⑹覝胤胖?4小時(shí)以上才能使用。充分混合的包埋劑同樣保存在4C中，一旦加入催化劑后，它的有效期便為12個(gè)月。

5.Lowicryl系列包埋劑 

    Lowicryl系列包埋劑是專為低溫（-20C以下）包埋設(shè)計(jì)的包埋劑。它有兩種類型：一種是極性樹脂，K4M（低滲透溫度為-30C，低聚合溫度為-50C}）和K11M（低滲透溫度為-60C，低聚合溫度為-60C）；另一種是非極性樹脂，HM20（低滲透溫度為-50C，低聚合溫度為-50C和HM23（低滲透溫度為-80C}，低聚合溫度為-80C}）。極性樹脂親水，使樣品保存在一個(gè)水性的環(huán)境中從而較少蛋白質(zhì)變性，且染色的效果較好。而非極性樹脂的切割性能比較好。兩種樹脂通常都在隔絕氧氣的情況下低溫紫外線照射聚合。Lowicryl系列包埋劑全部以試劑盒的形式出售，有詳細(xì)的說(shuō)明書提供參考。

6.滲透和包埋的注意事項(xiàng)

包埋過(guò)程中，一切器材用品都要干凈、干燥 

配制包埋劑時(shí)，每加一種試劑都要充分?jǐn)嚢杈鶆颍⒈M量防止產(chǎn)生氣泡 

若用Epon包埋，還要控制室內(nèi)的濕度（相對(duì)濕度在60%左右），否則聚合不均勻，造成切片困難，甚至包埋*失敗

包埋塊要保存在干燥器內(nèi)，以防吸濕 

7.怎樣從得到的圖像來(lái)指導(dǎo)包埋劑選擇

滲透和包埋引起的圖象缺陷主要由不合適的包埋劑配方引起。不合適的包埋劑配方能產(chǎn)生細(xì)胞器皺縮、切片擠壓等缺陷。環(huán)氧樹脂的聚合一般需要一種次級(jí)的非環(huán)氧化分子（硬化劑）。硬化劑和樹脂的環(huán)氧基反應(yīng)形成鍵，使單體結(jié)合在一起。樹脂的環(huán)氧基和硬化劑的反應(yīng)基之間的比率決定了聚合鏈的長(zhǎng)度，也決定了樹脂塊的切割性能。雖然切片的擠壓、顫痕和表面缺陷常受到超薄切片刀的質(zhì)量的影響。但優(yōu)化樹脂的配方，選擇合適的比例可以降低這種缺陷的形成。

一般來(lái)說(shuō)，在選擇包埋劑配方時(shí)，應(yīng)選擇與樣品的軟硬度相當(dāng)?shù)呐浞健＝M織或組織成分的腫脹也可能是包埋劑配方不當(dāng)引起的缺陷。如：當(dāng)切片從包埋塊中切下后浮于水表面時(shí)，含有組織成分的部分切片可能腫脹甚至在水面擴(kuò)散開來(lái)。這種情況的出現(xiàn)，是樹脂不均勻地滲透組織，特別是樹脂各組分的分離，導(dǎo)致了聚合不*的樹脂微池。這樣，組織、細(xì)胞和細(xì)胞器等基于它們被滲透的情況，可能以不同的速率發(fā)生腫脹（或收縮），從而導(dǎo)致切片變形甚至解體。