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免疫組化操作流程

來源:桑戈國際貿易(上海)有限公司   2014年01月21日 10:27  

(一)、儀器設備
  1. 18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或用微波爐.
  2. 水浴箱

(二)、試 劑
  1. PBS緩沖液(pH7.2―7.4)

  2.0.01mol/L檸檬酸鈉緩沖液(CB,pH6.0,1000ml
  3.0.5mol/L EDTA緩沖液(pH 8.0)
  4. 1mol/L的TBS緩沖液(pH 8.0)

  5. 酶消化液:a.0.1%胰蛋白酶  b.0.4%胃蛋白酶液
  6. 3%甲醇―H2O2溶液
  7. 風裱劑:a. 甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液(pH 9.0–9.5)等量混合b油和TBS(PBS)配制
  8.TBS/PBS pH 9.0–9.5,適用于熒光纖維鏡標本; pH 7.0-7.4適合光學纖維標本
(三)、操作流程
  1、脫蠟和水化

   脫蠟前應將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60℃恒溫箱中烘烤20分鐘。
  a 組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘,更換二甲苯后再浸泡10分鐘
  b 無水乙醇中浸泡五分鐘
  c 95%乙醇中浸泡五分鐘
  d 75%乙醇中浸泡五分鐘
  2、抗原修復

   用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片:
  A 抗原熱修復
  a 高壓熱修復 在沸水中加入EDTA(pH8.0)或0.01mmol/L枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH6.0).蓋上不銹鋼鍋蓋,但不能鎖定。將玻片置于金屬染色加上,緩慢加壓,是玻片在緩沖液中浸泡五分鐘,然后將蓋子鎖定,小閥門將會升起來。10分鐘后除去熱源,置入涼水中,當小閥門沉下去后打開蓋子。此方法適用于較難檢測或核抗原的抗原修復。b沸熱修復 電爐或水浴鍋加熱0.01枸櫞酸鈉緩沖液(pH 6.0)至95℃左右,放入組織芯片加熱10-15分鐘。 c微波爐加熱在微波爐里加熱0.01枸櫞酸鈉緩沖液(pH6.0)至沸騰后將組織芯片放入,斷電,間隔5-10分鐘,反復1-2次。適用的抗原:Bcl-2.Bax.AR.PR.C-fos.x-jum.z-kit.c-myc.E-cadherin.ChromograninA.Cyclin.ER.Heatshock.Protein.HPV.Ki-67.MDMZ.P53.P34.P15.P-glycoprotein.PKC.PCNA.ras.Rb.等
   B 酶消化方法

   在抗原酶消化修復中,常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預熱37℃,消化時間約為5-30分鐘。適用于被固定遮蔽的抗原:包括 Collagen.GFAP. Complement.Cytokeratin.C-erB-2.LCA.LN.等
   3、免疫組化染色SP法
  (1) 脫蠟、水化
  (2)PBS洗2-3次各5分鐘
  (3)3% H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上,室溫靜置10分鐘
  (4)PBS洗2-3次各5分鐘
  (5)抗原修復
  (6)PBS洗2-3次各5分鐘
  (7)滴加正常山羊血清封閉液,室溫20分鐘,甩去多余液體
  (8)滴加
Ι抗50μl,室溫靜置1小時或4℃次日或37℃1小時
  (9)4℃次日后需在37℃復溫45分鐘
  (10)PBS洗3次每次2分鐘
  (11)滴加Ⅱ抗45-50μl,室溫靜置或37℃1小時
  (12)Ⅱ抗中可加入0.05%的 tween-20.
  (13)PBS洗3次各5分鐘
  (14)DAB顯色5-10分鐘,在顯微鏡下掌握染色程度
  (15)PBS或自來水沖洗10分鐘
  (16)蘇木精復染2分鐘,鹽酸酒精分化
  (17)自來水沖洗10-15分鐘
  (18)脫水、透明、封片、鏡檢。
  4、SABC法
  (1) 脫蠟、水化
  (2)PBS洗2次各5分鐘
 (3)用蒸餾水或PBS配制新鮮的3%H2O2,室溫封閉5-10分鐘,用蒸餾水洗3次
  (4)抗原修復
  (5) PBS洗5分鐘  
  (6)滴加正常山羊血清封閉液,室溫20分鐘,甩去多余液體
  (7)滴加Ι抗50μl,室溫靜置1小時或4℃次日后或37℃1小時
  (8)PBS洗3次各2分鐘
  (9)滴加生物素化Ⅱ抗,20℃-37℃ 20分鐘
  (10)PBS洗3次各2分鐘
  (11)滴加試劑SABC 20℃-30℃ 20分鐘
  (12) PBS洗4次各5分鐘
  (13) DAB顯色:試劑盒或自配顯色劑顯色
  (14)脫水、透明、封片、鏡檢。

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