時(shí)間過(guò)的可真快呀,一月份都已經(jīng)過(guò)去三分之一啦,等待春節(jié)的到來(lái),真是激動(dòng)人心的,元旦剛過(guò),就是臘八節(jié)了,我公司還開(kāi)展了臘八*一周的*活動(dòng)哦!想了解的朋友們可以。
在昨天下午的時(shí)候,我公司接到了一個(gè)咨詢有關(guān)細(xì)胞冷凍的朋友來(lái)電,我公司很快地到了技術(shù)部人員為這位朋友解決了問(wèn)題。細(xì)胞也為我公司主營(yíng)產(chǎn)品之一,我公司王提出應(yīng)將ATCC細(xì)胞冷凍及解凍方法發(fā)布出來(lái)分享給其他的朋友們。
ATCC細(xì)胞冷凍?又如何解凍?
細(xì)胞冷凍及保存
材料:
生長(zhǎng)良好之培養(yǎng)細(xì)胞、新鮮培養(yǎng)基、DMSO、無(wú)菌塑料冷凍保存管、0.4%(w/v)trypan blue、血球計(jì)數(shù)盤(pán)與蓋玻片、等速降溫機(jī)。
冷凍保存方法:
1、傳統(tǒng)方法:冷存管置于4℃10分鐘→ -20℃30分鐘→ -80℃16~18小時(shí)(或隔夜)→液氮槽vaporphase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。-20℃不可超過(guò)1小時(shí),以防止冰晶過(guò)大,造成細(xì)胞大量死亡,亦可跳過(guò)此步驟直接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。
2、程序降溫:利用已設(shè)定程序的等速降溫機(jī)以-1~-3℃/分鐘之速度由室溫降至(-80℃以下)-120℃,再放在液氮槽vaporphase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma之保存。
步驟:
1、冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基,觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情形。
2、配制冷凍保存溶液(使用前配制):將DMSO加入新鮮培養(yǎng)基中,zui后濃度為5~10%,混合均勻,置于室溫下待用。
3、依細(xì)胞繼代培養(yǎng)之操作,收集培養(yǎng)之細(xì)胞,取少量細(xì)胞懸浮液(約0.1ml)計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。
4、離心,去除上清液,加入適量冷凍保存溶液,使細(xì)胞濃度為1~5×106cells/ml,混合均勻,分裝于已標(biāo)示*之冷凍保存管中,1ml/vial,并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測(cè)。
朋友們可要注意嘍:
1、欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長(zhǎng)良好(logphase)且存活率高之狀態(tài),約為80–90%致密度。
2、冷凍前檢測(cè)細(xì)胞是否仍保有其*性質(zhì),例如hybridoma應(yīng)在冷凍保存前一至二日測(cè)試是否有抗體之產(chǎn)生。
3、注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì)。DMSO應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí),無(wú)菌且無(wú)色(以0.22micron FGLP flon過(guò)濾或是直接購(gòu)買無(wú)菌產(chǎn)品,如Sigma D-2650),以5~10ml小體積分裝,4℃避光保存,勿作多次解凍。Glycerol亦應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí),以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開(kāi)啟后一年內(nèi)使用,因長(zhǎng)期儲(chǔ)存后對(duì)細(xì)胞會(huì)有毒性。
ATCC細(xì)胞
冷凍保存之細(xì)胞濃度:
1、normal
human fibroblast:1~3×106cells/ml
2、hybridoma:1~3×106cells/ml,細(xì)胞濃度不要太高,某些hybridoma會(huì)因冷凍濃度太高而在解凍24小時(shí)后死去。
3、adherent tumor
lines:5~7×106,依細(xì)胞種類而異。Adenocarcinoma解凍后須較高之濃度,而HeLa只需1~3×106cells/ml
4、other
suspensions:5~10×106cells/ml,human lymphocyte須至少5×106cells/ml。
5、冷凍保護(hù)劑濃度為5或10%DMSO,若是不確定細(xì)胞之冷凍條件,在做冷凍保存之同時(shí),亦應(yīng)作一個(gè)backup culture,以防止冷凍失敗。
冷凍細(xì)胞活化
1、冷凍細(xì)胞之活化原則為快速解凍,以避免冰晶重新結(jié)晶而對(duì)細(xì)胞造成傷害,導(dǎo)致細(xì)胞之死亡。
2、細(xì)胞活化后,約需數(shù)日,或繼代一至二代,其細(xì)胞生長(zhǎng)或特性表現(xiàn)才會(huì)恢復(fù)正常(例如產(chǎn)生單株抗體或是其它蛋白質(zhì))。
材料:37℃恒溫水槽、新鮮培養(yǎng)基、無(wú)菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶、液氮或干冰容器 。
步驟:
1、操作人員應(yīng)戴防護(hù)面罩及手套,防止冷凍管可能爆裂之傷害。
2、自液氮或干冰容器中取出冷凍管,檢查蓋子是否旋緊,由于熱脹冷縮過(guò)程,此時(shí)蓋子易松掉。
3、將新鮮培養(yǎng)基置于37℃水槽中回溫,回溫后噴以70%酒精并擦拭之,移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。
4、取出冷凍管,立即放入37℃水槽中快速解凍,輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化,以70%酒精擦拭保存管外部,移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。
5、取出解凍之細(xì)胞懸浮液,緩緩加入有培養(yǎng)基之培養(yǎng)容器內(nèi)(稀釋比例為1:10~1:15),混合均勻,放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取0.1ml解凍細(xì)胞懸浮液作存活測(cè)試。
6、解凍后是否立即去除冷凍保護(hù)劑(例如DMSO或glycerol),依細(xì)胞種類而異,一般而言,大都不需要立即去除冷凍保護(hù)劑。惟若要立即去除,則將解凍之細(xì)胞懸浮液加入含有5-10ml培養(yǎng)基之離心管內(nèi),離心1000rpm,5分鐘,移去上清液,加入新鮮培養(yǎng)基,混合均勻,放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
7、若不需立即去除冷凍保存劑,則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基。
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