1 主要配制試劑

1）0.5M Na2EDTA PH8.0

2） Proeinase K（20 μg/ul）

3）6M GuSCN 10ml

GuSCN 7.2g

加D·W至10ml

水浴60℃～65℃溶解

4） 二氧化硅懸浮液（Silica susponsion、用前混勻）

Silica 12g加D、W至100l

↓

充分混勻置于100ml量筒內室溫沉降24小時

↓

取上層溶液85ml加D、W至100ml，置于100ml量筒內充分混勻室沉降5小時

↓

取上層溶液85ml加12μl 10M HCL、充分混勻

分裝、高壓滅菌（121℃ 20min）備用。

5） 70%乙醇（-20℃）

6）丙酮（-20℃）

7）Nuclease free H2O

2 主要儀器

旋轉混搖器（rotator）

電泳儀

紫外分析儀

調速搖床（Rocker Platform）

Shimadzu UV-250型紫外分光光度計

3 操作步驟

3.1 樣本準備

1）骨：骨高壓滅菌細沙紙磨去骨表面0.5mm厚層，254nm紫外線照射1小時以防外源性DNA污染;然后用冷的去離子水、乙醇、各振搖15分鐘，取出干燥。將骨片放入盛有液氮搪瓷碗內用小型手電鉆鉆取骨粉備用。

2）牙：254nm紫外線照射1小時，然后用冷的去離子水、乙醇、各振搖15分鐘，干燥后在液氮中冷凍24小時。用高壓滅菌的密度白布包裹，榔頭敲擊成細粉沫備用。

3.2 骨、牙組織DNA分離和純化

1）流程圖

樣本+DNA提取buffer消化

↓

二氧化硅結合DNA

↓

70%乙醇、丙酮洗滌硅珠

↓

56℃洗提DNA

↓

去除二氧化硅

↓

轉移DNA溶液

↓

-20℃保存備用

2）操作

①取骨粉0.25g（牙粉沫0.1g）置于1.5Eppendorf管，加1.0ml 0.5M Na2EDTA（PH8.0）,25μl proteinase K（20μg/μl）。將Eppendorf管置于旋轉混搖器上，室溫混搖24小時。

②將樣品Eppendorf管置于56℃干熱器上繼續消化2小時。

③離心13000rpm，5分鐘。

④取上清液700μl移至另一潔凈1.5ml Eppendorf管中（棄沉渣），加700μl 6M GuSCN,20⑤μl二氧化硅懸浮液置于旋轉混搖器上，室溫混搖2小時。

⑤離心13000rpm，20秒，充上清液保留硅珠。

⑥用-20℃ 70%乙醇洗滌硅珠兩次，每次離心13000rpm,20秒。

⑦用-20℃丙酮洗滌一次，離心13000rpm,20秒。

⑧樣品Eppendorpf管置于56℃干熱器上，15分鐘洗提DNA，每5分鐘振搖一次。

⑨離心13000rpm 2分鐘，將60μl DNA溶液移至0.5ml Eppendorf中，置于-20℃保存備用。

3.3 DNA定量

3.3.1 凝膠定量

1）配制1%瓊脂糖凝膠：將2g瓊脂糖加入200ml 1×TBE緩沖液中，煮沸溶化，待冷卻至60℃加入10μlEB，充分混勻。

2）將瓊脂糖溶化液灌入制膠模具，放置30分鐘，使其冷卻固化。

3）小心取出加樣硫，將已制好凝膠放入電永槽，加1×TBE緩沖液使其高出膠面約1cm。

4）將標準含量（30μg/ml、20ng/ml、10ng/ml、50μg/ml）DNA樣品，標準DNA分子量Marker和可見性DNA參照置于干熱器孵育5分鐘，稍離心。

5）將可見性DNA參照物及用作下量尺度的標準量DNA各10μl及待測DNA樣品按從左向右依次加入膠中，兩側加標準DNA分子量Marker。

6）150v電壓電泳30分鐘。

7）紫外分析儀上觀察結果并照像，與標準品對照推算樣本DNA含量。

3.3.2 紫外分光光度計法

采用Shimadzu UV-250型紫外可見分光光度計測定DNA濃度，儀器預熱10分鐘，用1.0ml去離子水校正零點，吸取10μl DNA樣品加990μl去離子水混勻，轉入石英比色杯中。在260nm，280nm和320nm處讀出光密度。依據公式DNA樣品濃度=A260×核酸稀釋倍數×50‰;提取DNA溶液中蛋白含量=1.55×（A280-A320）-0.76×（A260-A320）進行計算，核酸純度由A260/A280的比率進行估計。

4 注意事項

1.本技術標準運用于自然條件下保存6～60年骨。

2.不同處理保存狀況對骨組織DNA穩定性影響不同（如加堿水煮，火燒等），骨組織DNA骨減少。

3.本技術采用高壓滅菌細砂紙磨去骨表面0.5mm厚層，254nm紫外線照射1小時消除外源性DNA污染。