相關基礎知識

限制性核酸內切酶：是一類能識別雙鏈DNA分子特異性核酸序列的DNA水解酶。它是基因工程中用于體外剪切基因片段的重要工具酶。

上世紀七十年代，當人們在對噬菌體的宿主特異性的限制-修飾現象進行研究時，發現了限制性內切酶。*被發現的限制性內切酶包括來源于大腸桿菌的EcoR I和EcoR II，以及來源于流感嗜血桿菌（Heamophilus influenzae）的Hind II和Hind III。這些酶可在特定位點切開DNA，產生可體外連接的基因片段。研究者很快發現內切酶是研究基因組成、功能及表達非常有用的工具。

1）寄主控制的限制與修飾現象

限制與修飾系統是細菌細胞的一種防衛手段。各種細菌都能合成一種或幾種能夠切割DNA雙鏈的核酸內切酶，它們以此來限制外源DNA存在于自身細胞內，但合成這種酶的細胞自身的DNA不受影響，因為這種細胞還合成了一種修飾酶，對自身的DNA進行了修飾，限制性酶對修飾過的DNA不能起作用。這種現象被稱為寄主控制的限制與修飾現象。

2）限制性核酸內切酶的類型及特性

按限制酶的亞基組成和切斷核酸情況 的不同，分為三類：

Ⅰ型

Ⅱ型*

Ⅲ型

*類（I型）限制性內切酶能識別專一的核苷酸順序，它們在識別位點很遠的地方任意切割DNA鏈，其切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨機的。這類限制性內切酶在DNA重組技術或基因工程中用處不大，無法用于分析DNA結構或克隆基因。這類酶如Eco B、Eco K等。

第三類（III型）限制性內切酶也有專一的識別順序，在識別順序旁邊幾個核苷酸對的固定位置上切割雙鏈。但這幾個核苷酸對也不是特異性的。因此，這種限制性內切酶切割后產生的一定長度DNA段，具有各種單鏈末端。因此也不能應用于基因克隆。

第二類（II型）限制性內切酶能識別專一的核苷酸順序，并在該順序內的固定位置上切割雙鏈。由于這類限制性內切酶的識別和切割的核苷酸都是專一的。因此，這種限制性內切酶是DNA重組技術中zui常用的工具酶之一。

這種酶識別的專一核苷酸順序zui常見的是4個或6個核苷酸，少數也有識別5個核苷酸以及7個、8個、9個、10個和11個核苷酸的。這種酶的切割可以有兩種方式：

粘性末端 ;是交錯切割，結果形成兩條單鏈末端，這種末端的核苷酸順序是互補的，可形成氫鍵，所以稱為粘性末端。

各有一個單鏈末端，二條單鏈是互補的，其斷裂的磷酸二酯鍵以及氫鍵可通過DNA連接酶的作用而“粘合”。

平頭末端：

II型酶切割方式的另一種是在同一位置上切割雙鏈，產生平頭末端。例如EcoRV 的識別位置是：

3）同裂酶和同尾酶：

同裂酶：有時兩種限制性內切酶的識別核苷酸順序和切割位置都相同，這些有相同切點的酶稱為同裂酶（同切酶或異源同工酶）。

同裂酶差別只在于當識別順序中有甲基化的核苷酸時，一種限制性內切酶可以切割，另一種則不能。例如Hpa Ⅱ和MspⅠ的識別順序都是

5’……G| CG G……3’

3’……G GC| G……5’

如果其中有5’-甲基胞嘧啶，則只有Hpa Ⅱ能夠切割。

同尾酶：

有時兩種酶切割序列不*相同，但卻能產生相同的粘性末端，這類酶被稱為同尾酶

同尾酶的切割產物可以通過DNA連接酶將這類末端連接起來，但原來的酶切位點將被破壞。

4）限制性核酸內切酶的命名法

用屬名的頭一個字母和種名的頭兩個字母表示寄主菌的物種名稱，如E.coli 用Eco表示，所以用斜體字。

用一個字母代表菌株或型，如流感嗜血菌（Heamophilus influenzae）Rd菌株用d，即Hind。

如果一種特殊的寄主菌株，具有幾個不同的限制與修飾酶，則以羅馬數字表示，如Hind Ⅰ,Hind Ⅱ，Hind Ⅲ等。

3.酶切反應的設計一般應注意問題:

1）大多數限制酶貯存在50%甘油溶液中，以避免在-20℃條件下結冰。當zui終反應液中甘油濃度大于12%時，某些限制酶的識別特異性降低，從而抑制酶活性。因此加入反應的酶體積不超過反應總體積的10%。

2）反應混合物中基因組DNA底物的濃度不宜太大，小體積中過高濃度的基因組DNA會形成粘性DNA溶液,從而抑制酶的擴散，并降低酶活性。建議酶切反應的基因組DNA濃度為0.1-0.4μg/μl。同時RNA應該盡量消化去除。

3）當要用兩種或兩種以上限制酶切割DNA時，必須選擇好通用緩沖液，則兩種酶才可同時切割。

4）酶切底物DNA應具備一定的純度，其溶液中不能含有跡量酚、氯仿、乙醇，大于10mM的EDTA，SDS以及過量的鹽離子濃度，否則會不同程度地影響限制酶的活性。

5）反應混合液中加入濃度為0.1mg/ml的BSA，可維持酶的穩定性。

4.酶切實驗中的注意事項:

1）反應取酶時應使用無菌吸頭，以免污染酶液，同時應盡量縮短酶在溫室的放置時間。

2）反應混合物混勻時，應避免強烈振蕩以保證不使內切酶變性及DNA大分子的完整。

3）反應前的低速離心是必要的，這可使因混勻吸附于管壁上的液滴全部沉至管底。

4）終止酶反應可根據需要采用不同的方法：

①酶切后不需進行下一步反應，可加入含EDTA的終止液終止反應。

②若需進一步反應（如連接，切割等），可將反應管置65℃保溫20-30分鐘，以滅活酶，終止反應。

③可用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。

5.酶切實驗設計的一般思路:

6.實驗材料與儀器

•質粒 pUCm-T-TaSTK

•RNase

用含有10mmol/LTris-HCl、15mmol/L NaCl溶液溶解Rnase到10mg/ml，沸水浴15min，保存到-20℃

•SacI 和 XbaI 核酸內切酶（Takara）

•酶解緩沖液（10×M buffer）

•離心機，水浴鍋

•10ml，50ml微量移液器，無菌的1.5ml EP管

實驗方法和步驟

1）質粒中RNA的酶

向30ml質粒溶液中加入10mg/ml Rnase 2ml，37℃水浴酶解0.5小時。

2）質粒DNA的限制性內切酶酶

Total ddH2O M Buffer SacI XbaI 質粒DNA

20ml 13ml 2ml 1ml 1ml 3ml

置于37℃水浴酶解16小時。酶解完成后，分別加入10倍的上樣緩沖液,然后各取15ml進行電泳分析。