1.了解細(xì)胞

來自加拿大多倫多大學(xué)的Peter Zandstra實驗室的一項研究項目就是：通過從單層細(xì)胞懸浮液中收集人類胚胎干細(xì)胞hESCs，提高h(yuǎn)ESC分化的一致性和產(chǎn)量。

人類胚胎干細(xì)胞hESCs和人類誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞hiPSCs的分化需要細(xì)胞聚集，但是細(xì)胞團(tuán)中的細(xì)胞常常大小和形狀不一，從而導(dǎo)致不同步分化。為了能解決一致性的問題，Zandstra實驗室的博士后Mark Ungrin嘗試?yán)靡恍┕_的實驗指導(dǎo)手冊獲取單細(xì)胞懸浮液聚集體，剛開始的時候，他能得到穩(wěn)定的聚集細(xì)胞，但是之后這些細(xì)胞就紛紛死了，他回憶道，“不同實驗中細(xì)胞的大小都不一致，有時我在一個孔里能發(fā)現(xiàn)幾種聚集細(xì)胞。”

Ungrin花了6個月的時間鉆研細(xì)胞培養(yǎng)基，之后，他開始轉(zhuǎn)向細(xì)胞本身，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了兩個重要的因素：一個是他驚訝的發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過幾代傳代的成熟的hESCs一般都會形成穩(wěn)定的細(xì)胞聚集，而在分化前階段的細(xì)胞則傾向于形成單細(xì)胞懸浮，因此Ungrin決定在細(xì)胞分化之前收集細(xì)胞。另外一個發(fā)現(xiàn)就是一種Rho關(guān)聯(lián)的激酶，這種小分子抑制劑在之前的研究中發(fā)現(xiàn)能提高細(xì)胞存活率，Ungrin發(fā)現(xiàn)對于他的干細(xì)胞，這種小分子也起作用。

Ungrin表示，“進(jìn)行人類胚胎干細(xì)胞研究zui令人頭疼的事之一，就是你在實驗室中做的工作很難重復(fù)，而你又不知道是什么原因”，即使是用不同的移液器進(jìn)行平板轉(zhuǎn)移，也有可能造成不同的結(jié)果。因此Ungrin建議研究人員除了記住培養(yǎng)基，還要記住自己細(xì)胞的年齡階段和狀態(tài)，這些都會影響存活率。

干細(xì)胞培養(yǎng)確實是頗令人煩惱的一項實驗過程，這是許多剛進(jìn)行干細(xì)胞研究的實驗人員所沒有意料到的，不過通過越來越多積累的實戰(zhàn)經(jīng)驗也許能漸漸悟出其中的前因后果，不過也可以利用一些商品化的產(chǎn)品幫助我們盡快的解決這些問題。

針對干細(xì)胞培養(yǎng)，的細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品公司HyClone（屬于Thermo Scientific）推出了AdvanceSTEM系列產(chǎn)品，這一系列產(chǎn)品主要支持小鼠干細(xì)胞研究的各種應(yīng)用，包括細(xì)胞擴(kuò)增，保持小鼠胚胎干細(xì)胞和人成體間質(zhì)干細(xì)胞的未分化狀態(tài)，將間質(zhì)干細(xì)胞專一的分化成神經(jīng)元，脂肪細(xì)胞，軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞等類型的細(xì)胞等等。

其中AdvanceSTEM™推薦的DMEM是一款低滲DMEM，這款產(chǎn)品具備一般常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)的影響因素（生長因子等），重要的是具有與小鼠胚胎干細(xì)胞相近的*滲透壓，而且其特異的配方保證在37℃5%CO2的培養(yǎng)條件下能夠保持生理狀態(tài)下的pH，這些對干細(xì)胞生長和保持一致性非常有好處，另外可以在這個DMEM中加入AdvanceSTEM™血清替代物，幫助使胚胎干細(xì)胞保持在未分化的狀態(tài)，AdvanceSTEM™血清替代物是一種無血清培養(yǎng)物，血清是動物細(xì)胞離體培養(yǎng)常見的培養(yǎng)液，在某些情況下不能用血清培養(yǎng)細(xì)胞，比如觀察一種生長因子對某種細(xì)胞的作用。

另外Invitrogen公司在今年5月就推出了*間充質(zhì)干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，專門用于間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）或來源于骨髓的干細(xì)胞的培養(yǎng)。STEMPRO MSC SFM是*限定的，意味著培養(yǎng)基中的每一種成分都是已知量的，因而排除了顯著的批間差。這個培養(yǎng)基能使MSC維持未分化狀態(tài)超過9代，而用傳統(tǒng)的加血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞在5代后就開始出現(xiàn)分化。此外，Invitrogen還推出了一種*限定的無動物來源的干細(xì)胞基質(zhì)，用于胚胎、間充質(zhì)和神經(jīng)干細(xì)胞的附著和擴(kuò)增。（其中STEMPRO MSC SFM入圍了本年度創(chuàng)新產(chǎn)品評比的候選名單，歡迎大家投票）

2.尋找標(biāo)記

來自維吉尼亞共和國大學(xué)在干細(xì)胞生物工程學(xué)家Raj Rao希望能利用細(xì)胞表面標(biāo)記物了解人類胚胎干細(xì)胞，進(jìn)而調(diào)控胚胎干細(xì)胞，但是目前對于評估hESCs的多能性，以及胚胎干細(xì)胞在分化的時候會產(chǎn)生什么樣的變化，并沒有設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)。通常采用的細(xì)胞標(biāo)記包括階段特異性胚胎抗原3和抗原4（SSEA-3和SSEA-4），但是不同的細(xì)胞系在SSEA-3和SSEA-4的表達(dá)上差別較大，很難統(tǒng)一。

為了解決這個問題，Rao利用了一種在胚胎發(fā)育過程中結(jié)合和修飾細(xì)胞表面糖組分的蛋白：凝集素lection。小鼠ESC有關(guān)的文獻(xiàn)表明，在發(fā)育的植入前和植入階段，凝集素受體會展示在細(xì)胞表面。Rao研究小組對14種不同的凝集素進(jìn)行了分析，希望能找到與SSEA-4同時表達(dá)的凝集素，結(jié)果他們發(fā)現(xiàn)了一些這種蛋白，比如蓖麻凝聚素（Ricinus communis agglutinin），懷槐凝集素（Maackia amurensis），這些蛋白可以緊緊的結(jié)合在hESCs上，能用于預(yù)測多能性。

Rao表示，你實驗的標(biāo)記越多，那么就越能證明細(xì)胞的多能性。對于希望進(jìn)行凝集素檢測實驗的研究人員而言，這種方法相對直接和便宜，需要的只是一些抗體，和一臺臺式的流式細(xì)胞儀。

但是要記住，對于不同的細(xì)胞系，甚至是同一細(xì)胞系的不同細(xì)胞群，凝集素和其它細(xì)胞表面標(biāo)記物，比如SSEA-4的表達(dá)都是不相同的，要想增加結(jié)果的可信度，可行的一個辦法就是增加分析樣品的數(shù)目。

其中Rao提到的這兩種抗體，默克，Invitrogen等廠家可以提供，至于臺式流式細(xì)胞儀，可以考慮下占市場較大份額的公司：美國的BD（Becton Dickinson）公司和貝克曼Beckman Coulter公司（原名稱Couter）。

BD的流式細(xì)胞儀，不消說，是經(jīng)典中的經(jīng)典，其生產(chǎn)的產(chǎn)品都冠以FACs（fluorescence-activated cell sorter）熒光激活細(xì)胞分選儀的名稱——FACs即流式細(xì)胞儀的縮寫，這不僅說明了BD生產(chǎn)流式細(xì)胞儀的時間早，也說明了其流式細(xì)胞儀的品質(zhì)高，近期國內(nèi)進(jìn)行的重組桿狀病毒的研究就是利用的他家的流式細(xì)胞儀。BD的流式細(xì)胞儀產(chǎn)品型號比較齊全，包括FACSCount（小型流式細(xì)胞儀）、FACSCAlibur（流式細(xì)胞儀）、FACSAria（流式細(xì)胞分選儀）、FACSVantage SE（多色分析和高速分選流式細(xì)胞儀）、LSRII（數(shù)字化分析型流式細(xì)胞儀）。這些流式細(xì)胞儀各有各的特點，比如FACSAria流式細(xì)胞分選儀這種臺式高速細(xì)胞分選儀的出現(xiàn)大大提高了分選性能，同時還增強了其它功能（具體可見2008技術(shù)點評：流式細(xì)胞分選）。

近期BD還推出了干細(xì)胞分選試劑盒，這種即用型的多能干細(xì)胞鑒定和分選試劑盒包括了預(yù)滴定的熒光標(biāo)記抗體，實驗設(shè)定磁珠、驗證過的實驗步驟以及軟件分析模板。此試劑盒針對現(xiàn)有的BD流式細(xì)胞儀優(yōu)化過，開箱即用。即使經(jīng)驗不多的流式細(xì)胞儀用戶，也能快速掌握這種方法。它同時將分析與分析之間的變異性減至zui低，讓結(jié)果更快更可靠。在抗體用完之后，能輕松補充抗體，滿足特別的研究需求。

另外Beckman Coulter推出的適合篩選量大的實驗室的流式細(xì)胞儀，可以用于生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究以及臨床檢測的許多領(lǐng)域，如遺傳、腫瘤、血液、免疫等諸多研究中紅細(xì)胞、T細(xì)胞、淋巴細(xì)胞亞群測定、檢測早期細(xì)胞凋亡、腫瘤細(xì)胞免疫測定等。

除了這兩個*，也可以考慮其它流式細(xì)胞儀，比如Accuri Cytometers、Guava科技公司、Union Biometrica、Amnis等，近期Guava科技公司與Millipore公司宣布將會獎勵給一名科學(xué)家一臺Guava的流式細(xì)胞儀，價值10萬美元，條件是這名科學(xué)家的創(chuàng)新研究計劃將會推動對細(xì)胞生物學(xué)的了解。申請時間為2009年的1月1日到4月30日，在Millipore和Guava的上都可提交（www.millipore.com 和www.guavatechnologies.com）。有興趣的國內(nèi)科學(xué)家可以試一下。

3.防止污染

薩克生物研究學(xué)院（the Salk Institute for Biological Studies）的Travis Berggren研究小組通過成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層研究hESC自我更新調(diào)控。但是05年Berggren在WiCell研究院進(jìn)行研究的時候，許多實驗室的細(xì)胞被支原體污染，這種污染物具有抵抗抗生素的能力，并且不容易觀察到。

研究小組花了兩個星期的時間清洗細(xì)胞和培養(yǎng)物，滅菌消毒，但是他們浪費的不只是兩個星期的工作時間，由于支原體生長很慢，并且不會干擾分化，因此研究人員長達(dá)一個月的時間都不知道所研究的細(xì)胞已經(jīng)被污染，即使在發(fā)現(xiàn)了污染物后，一些合作研究人員即使檢測到了污染，仍然認(rèn)為他們的細(xì)胞能存活，Berggren說，“這告訴我們，實際上早就應(yīng)該進(jìn)行檢測了。”

因此Berggren的研究小組建立了一個常規(guī)檢測過程，在其后的三年里他們都嚴(yán)格執(zhí)行著這一步驟，每個星期他們都會通過支原體特異性酶或DNA檢查新培養(yǎng)物，每2-4個星期檢查舊培養(yǎng)物。所有新的培養(yǎng)物質(zhì)，比如用在飼養(yǎng)層的小鼠成纖維細(xì)胞，都會先經(jīng)過檢查，并且在使用培養(yǎng)物之前，他們都會至少驗證兩次。

對于將小鼠ESCs的研究轉(zhuǎn)向人類ESCs研究的實驗室而言，支原體特別的麻煩，這是因為人類干細(xì)胞在操作上更難，它們更易失去分化潛力，或者死亡。進(jìn)行hiPSCs研究的實驗室也需要注意這個污染問題。

對于這種情況首先需要的是預(yù)防，確保細(xì)胞來源和培養(yǎng)物沒有受到支原體的感染，再來就是需要及時的發(fā)現(xiàn)支原體感染，檢測支原體的方法有很多，包括肉眼觀測方法，PCR方法，熒光檢測方法，電鏡檢測方法等，其中比較常見的是PCR方法和熒光檢測方法，前者譬如Sigma-Aldrich，Stratagene等公司都有相關(guān)的試劑盒，后者用的比較多的是Hoechst公司的相關(guān)產(chǎn)品，具體可見支原體細(xì)胞培養(yǎng)中的大敵。

4.干細(xì)胞分化

美國ATCC干細(xì)胞中心的華人科學(xué)家馬武（Wu Ma，音譯）研究組在細(xì)胞外基質(zhì)ECM對于干細(xì)胞自我更新和分化十分關(guān)鍵的這一理論的基礎(chǔ)上，希望能了解ECM中有哪些元素對于干細(xì)胞形成神經(jīng)祖細(xì)胞具有決定作用。

他們檢測了兩個不同的hESCs系，將這兩個細(xì)胞系鋪在五種不同的基質(zhì)表面：多聚賴氨酸（poly-D-Lysine），纖維粘連蛋白（fibronectin）,人層連蛋白（laminin）,I型膠原蛋白（type 1 collagen），以及Matrigel（BD公司的一種ECM），結(jié)果他們發(fā)現(xiàn)laminin上培養(yǎng)的細(xì)胞是分化得的，研究人員也發(fā)現(xiàn)這種效果也與干細(xì)胞整合素受體有關(guān)，因為阻斷a6b1受體會減緩分化。

雖然馬博士發(fā)現(xiàn)了于他的基質(zhì)，但是這并沒有給出一個“包治百病”的“藥方”：同一培養(yǎng)機制對于不同的細(xì)胞系具有不同的效果，因此馬博士建議，在選擇培養(yǎng)物和其它介質(zhì)的時候，不僅要了解過去的干細(xì)胞研究的微環(huán)境如何，還要仔細(xì)看看正常體內(nèi)發(fā)育過程中所涉及的細(xì)胞因子。比如說要分化成神經(jīng)細(xì)胞，那么就可以看看哪些是大腦發(fā)育過程中常見的因子，不過也要注意這也是有局限性的，一些人類胚胎干細(xì)胞系在同樣的培養(yǎng)條件下也會產(chǎn)生多少不一的神經(jīng)細(xì)胞。