4.1.1 DNA的連接策略

質(zhì)粒具有穩(wěn)定可靠和操作簡便的優(yōu)點。如果要克隆較小的dna段（<10kb）且結構簡單，質(zhì)粒要比其它任何載體都要好。在質(zhì)粒載體上進行克隆，從原理上說是很簡單的，先用限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒DNA和目的DNA段，然后體外使兩者相連接，再用所得到重組質(zhì)粒轉化細菌，即可完成。

外源DNA段和質(zhì)粒載體的連接反應策略有以下幾種：

（1）互補性粘性末端的連接

單一限制性內(nèi)切酶或兩種限制性內(nèi)切酶（為同尾酶，如BamHI和BglII）分別處理載體和外源DNA，得到的粘性末端為互補性突出末端，在連接反應中外源片段和質(zhì)粒載體DNA均可能發(fā)生自身環(huán)化或幾個分子串連形成寡聚物，且正反兩種連接方向都可能有。為了降低載體的自身環(huán)化，使正確的連接產(chǎn)物數(shù)量達到zui高水平，一般載體DNA和外源DNA的分子數(shù)比（濃度比）為1：3～1：10之間。同時，為了zui大限度地抑制質(zhì)粒DNA的自身環(huán)化，還可將載體DNA的5’磷酸基團用堿性磷酸酯酶去掉，防止其自身環(huán)化。而帶5’端磷酸的外源DNA段可有效地與去磷酸化的載體相連，產(chǎn)生一個帶有兩個缺口的開環(huán)分子，在轉入E.coli受體菌后該種缺口可在DNA復制過程種自動修復。

（2）非互補粘性末端的連接

用兩種不同的限制性內(nèi)切酶進行消化可以產(chǎn)生帶有非互補的粘性末端，這DNA重組中zui容易克隆的DNA段。一般情況下，常用質(zhì)粒載體均帶有多個不同限制酶的識別序列組成的多克隆位點，因而幾乎總能找到與外源DNA段末端匹配的限制酶切位點的載體，從而將外源片段定向地克隆到載體上。也可在pcr擴增時，在DNA段兩端人為加上不同酶切位點以便與載體相連。該種粘性末端的連接載體DNA和外源DNA的分子數(shù)比（濃度比）通常為為1：1。

（3）平頭末端的連接

是由產(chǎn)生平末端的限制酶或核酸外切酶消化產(chǎn)生，或由DNA聚合酶補平所致。由于平端的連接效率比粘性末端要低得多，故在其連接反應中，T4 dna連接酶的濃度和外源DNA及載體DNA濃度均要高得多。通常還需加入低濃度的聚乙二醇（PEG 8000）以促進DNA分子凝聚成聚集體的物質(zhì)以提高轉化效率。特殊情況下，外源DNA分子的末端與所用的載體末端無法相互匹配，則可以在線狀質(zhì)粒載體末端或外源DNA段末端接上合適的接頭（linker）或銜接頭（adapter）使其匹配，也可以有控制的使用E. coli DNA聚合酶Ⅰ的klenow大片段部分填平3’凹端，使不相匹配的末端轉變?yōu)榛パa末端或轉為平末端后再進行連接。

4.1.2 DNA連接酶類型

能用于連接DNA的酶有2種：大腸桿菌連接酶和大腸桿菌T4噬菌體所編碼的T4-DNA連接酶。前者的反應需要NAD+參與催化，而T4連接酶的反應則需要ATP參與催化。zui初的研究表明，大腸桿菌連接酶只能催化粘端的連接，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)在PEG或聚蔗糖存在的條件下，也能進行平端的連接。相比較而言，T4-DNA連接酶并不需要PEG等的存在就能進行平端的連接，所以現(xiàn)在實驗中絕大多數(shù)情況下使用T4-DNA連接酶。

4.1.3 DNA連接的影響因素

連接反應的影響因素包括溫度，時間，酶量，緩沖體系，DNA末端的性質(zhì)（見4.1.1）及濃度，DNA段的大小等。

（1）溫度與時間

連接反應的一項重要參數(shù)是溫度，理論上連接反應的*溫度是37℃，此時連接酶的活性zui高。但37℃時粘性末端分子形成的氫鍵配對結構極不穩(wěn)定，因此人們找到了一個既可zui大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又有助于短暫配對結構穩(wěn)定的zui適溫度即12~16℃。一般粘性末端的連接在此溫度下，反應30min即可取得較好的效果，如時間充裕的話連接60min則更*些，為了實驗方便有時也在4℃條件下連接過。而對于平頭末端的連接，建議在37℃條件下連接，并且時間適當延長。

（2）酶量

酶單位的定義在寶生物工程公司提供的T4-DNA連接酶中是指在20ml的連接發(fā)應體系中，6mg的l DNA-HindIII的分解物在16℃下發(fā)應30min時，有90%以上的DNA段進行連接的酶量為1U。由以上的定義可知，日常連接實驗中的DNA的濃度比酶量定義的狀態(tài)下低很多10～20倍，所以實際酶量是過量的。平頭末端的連接酶的用量要比粘性末端連接所需酶量大10~100倍，因此廠商提供的連接酶濃度往往是高濃度的（寶生物的T4-DNA連接酶濃度350U/ml）。故從這個意義上分析，常規(guī)的粘性末端的連接反應體系中酶量的加入往往是過量的。

（3）緩沖體系

不同公司的連接酶緩沖液大部分含有Tris-HCl（pH 7.5）提供連接所需的合適pH值。另外在緩沖液中還有兩種主要成份非常重要：DTT和ATP。前者提供一定的還原能力，而后者能促進連接反應的有效進行。但是在實驗中緩沖液使用時的反復凍融會引起ATP的分解，從而影響連接效率。為了保證實驗的順利進行，一般大劑量的緩沖液可以分裝成小管保存并使用，另外可考慮使用一段時間的緩沖液定期更新一下。

（4）DNA濃度

DNA連接反應中建議的DNA連接濃度為0.1~1pmol/ml，，而為了降低載體分子間的環(huán)化，載體DNA的濃度不宜過高，外源DNA的投入量則依據(jù)連接類型不同投入1～10倍。

4.2 試劑與器材

1. 試劑 （1）外源DNA和載體DNA

（2）T4-DNA連接酶

2. 器材 （1）eppendorf管、槍頭

（2）移液器

4.3實驗步驟

4.3.1 常規(guī)DNA分子的連接

（1）用適當限制酶消化載體質(zhì)粒和外源DNA，必要時用瓊脂糖凝膠電泳分離片段。

（2）載體DNA取A ml，外源DNA取B ml，充分混勻后于42℃保溫10分鐘后，迅速冷卻到0℃（可省略，熱脈沖是為了提高兩種DNA分子碰撞的概率）。

（3）再按設計的反應體系依次加入：10×T4-緩沖液，T4-DNA連接酶。

（4）置于16℃連接1h以上，待用。

建議連接體系（可根據(jù)樣品濃度進行適當調(diào)整）：

ddH2O（ml） 外源DNA（ml） 載體DNA（ml） Buffer（ml） Enzyme（ml） Total（ml）

13-A-B B A 1.5 0.5 15

4.3.2 PCR產(chǎn)物與T-載體連接

（1）回收的PCR擴增產(chǎn)物直接與pMD18-T載體連接，連接反應按如下：

5×Buffer pMD18-T PCR產(chǎn)物 T4-DNA ligase ∑

2ml 0.5ml 7ml 0.5ml 10ml

（2）16℃連接1h以上，用于轉化。