MC3T3細胞相關操作：

培養條件：

每兩天換液一次

無菌恒溫培養箱

37℃

5% CO2

PH值7.2~7.4

*培養基成分: 不含酚紅 α-MEM、10% FBS, 0.1 mg/mL L-谷氨酸鹽, and 1% 雙抗（100 U ml−1 青霉素 and 100 μg ml−1 鏈霉素）,（ 20 mM HEPES?）

誘導成骨細胞分化：上述+50 μg/mL 抗壞血酸and 10 （5？）mM β-磷酸甘油

細胞復蘇

1.37°C水浴預熱培養基（αMEM+10% FBS）；

2.從液氮中取出細胞迅速放入37°C水浴快速解凍（解凍后不要繼續暖細胞）；

3.在超凈臺中加入5ml培養基重懸細胞，1000rpm離心5min；

4.棄上清，加入5ml培養基重懸細胞后轉入T25培養瓶中，輕輕晃勻；

5.置于37°C，5% CO2培養箱中培養（培養瓶蓋沒有透氣孔的話，瓶蓋不要擰太緊）；

6.第二天，用新鮮的培養基給細胞換液后繼續培養。

細胞傳代

1.當細胞融合度達到90%以上時，給細胞傳代；

2.37°C水浴預熱培養基（αMEM+10% FBS）；

3.在超凈臺中，棄培養基，加入2-5mlPBS清洗細胞后，再加入1ml胰酶消化細胞；

4.顯微鏡下觀察到細胞變圓，有細胞開始脫離瓶壁時，加入5ml培養基（αMEM+10% FBS）終止消化；

5.用移液器輕輕吹下瓶壁上剩余的細胞，并輕輕吹打將細胞吹散；

6.將細胞移入離心管中，1000rpm離心5min；

7.棄上清，加入15-20ml的培養基（含血清）重懸細胞后轉入T75培養瓶中或按適當比例傳到T25瓶中（確保細胞貼壁后融合度在25-50%之間），細胞密度在1×104 cells/cm2 （2.5×105 cells/T-25瓶），混勻細胞懸液，確保細胞均勻分布；

8.將培養瓶置于37°C，5% CO2的無菌培養箱中培養。

骨髓間充質干細胞培養方法：

培養基：D-MEM（低糖）（450 mL）、10%FBS（50ml）、10mg/mL慶大霉素（250ul）、0.1 mg/mL L-谷氨酸鹽

無菌恒溫培養箱

37℃

5% CO2

1、接種細胞后，每48h更換一次培養基。每周傳代兩次，傳代時機選在分裂率為1：3或1：4時進行。通常試驗選用3-8傳代細胞。

2、細胞鑒定：

①第四傳代，去除培養基，加入3 ml of 0.25% （重量/體積） 胰蛋白酶/0.02% （重量/體積） EDTA，室溫下消化3min。沖洗細胞，加入1 ml冷PBS（4—8℃），4℃下300g離心8min，離心兩次。每個離心管中用100ul冷PBS懸浮1×106個細胞，使用抗鼠FITC標記Sca-1, CD11b and CD45抗體染色，或者是PE標記  CD29, CD31, CD34, CD44, CD86, CD105, Ia抗體染色，留一管用作對照。

②細胞在暗環境下于4℃環境中染色30min

③沖洗細胞，加入1 ml冷PBS（4—8℃），4℃下300g離心8min，離心兩次。

④為了評估細胞生活狀況，在300ul冷PBS中加入PI（0.6 µg 每百萬細胞），加入細胞中，室溫暗環境下孵育15min。

⑤采用流式細胞儀分析細胞。使用FL1、FL2發射通道。每個樣本收集201,000個事件。

3、成骨細胞分化：

①第四傳代，去除培養基，加入3 ml of 0.25% （重量/體積） 胰蛋白酶/0.02% （重量/體積） EDTA，室溫下消化3min。

②24孔每孔接種1 × 104 個細胞。培養基為α-MEM，10% （體積分數） FBS, 10 − 7 M 地塞米松, 10 mM β-甘油磷酸鈉 and 50 µM 2-磷酸抗壞血酸鹽，每孔培養基500ul。

③每周更換兩次培養基，培養2-4周，該期間細胞不傳代

④14天后，使用Alkaline Phosphatase Kit在6孔板上測定ALP活性。

⑤再培養14d。

⑥von Kossa染色評估礦化情況，每孔將培養基替換為多聚甲醛，處理30min

⑦每孔用3ml蒸餾水沖洗3min，共沖洗3遍

⑧每孔以300 µl，5%（wt/vol）硝酸銀溶液染色，在光下孵育30min

⑨每孔用3ml蒸餾水沖洗3min，共沖洗3遍

10吸凈水，每孔加入300 µl，5% （wt/vol）硫代硫酸鈉溶液，處理5min

11每孔用3ml蒸餾水沖洗3min，共沖洗3

                           艾澤信：www.ai-zx.com