一、 噬菌體展示技術(shù)的原理

噬菌體展示技術(shù)是將多肽或蛋白質(zhì)的編碼基因或目的基因片段克隆入噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，在閱讀框正確且不影響其他外殼蛋白正常功能的情況下，使外源多肽或蛋白與外殼蛋白融合表達(dá)，融合蛋白隨子代噬菌體的重新組裝而展示在噬菌體表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相對(duì)獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，以利于靶分子的識(shí)別和結(jié)合。肽庫(kù)與固相上的靶蛋白分子經(jīng)過(guò)一定時(shí)間孵育后，洗去未結(jié)合的游離噬菌體，然后以競(jìng)爭(zhēng)受體或酸洗脫下與靶分子結(jié)合吸附的噬菌體，洗脫的噬菌體感染宿主細(xì)胞后經(jīng)繁殖擴(kuò)增，進(jìn)行下一輪洗脫，經(jīng)過(guò)3輪～5輪的“吸附-洗脫-擴(kuò)增”后，與靶分子特異結(jié)合的噬菌體得到高度富集[2]。所得的噬菌體制劑可用來(lái)做進(jìn)一步富集有期望結(jié)合特性的目標(biāo)噬菌體。

二、 噬菌體展示系統(tǒng)

2.1 單鏈絲狀噬菌體展示系統(tǒng)

（1）PⅢ展示系統(tǒng)。

絲狀噬菌體是單鏈DNA病毒，PⅢ是病毒的次要外殼蛋白，位于病毒顆粒的尾端，是噬菌體感染大腸埃希菌所必須的。每個(gè)病毒顆粒都有3個(gè)～5個(gè)拷貝PⅢ蛋白[3]，其在結(jié)構(gòu)上可分為N1、N2和CT 3個(gè)功能區(qū)域[4-5]，這3個(gè)功能區(qū)域由兩段富含甘氨酸的連接肽G1和G2連接。其中，N1和N2與噬菌體吸附大腸埃希菌菌毛及穿透細(xì)胞膜有關(guān)[6]，而CT構(gòu)成噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)的一部分，并將整個(gè)PⅢ蛋白的C端結(jié)構(gòu)域錨定于噬菌體的一端[7]。PⅢ有2個(gè)位點(diǎn)可供外源序列插入，當(dāng)外源的多肽或蛋白質(zhì)融合于PⅢ蛋白的信號(hào)肽（SgⅢ）和N1之間時(shí)，該系統(tǒng)保留了完整的PⅢ蛋白，噬菌體仍有感染性;但若外源多肽或蛋白直接與PⅢ蛋白的CT結(jié)構(gòu)域相連，則噬菌體喪失感染性，這時(shí)重組噬菌體的感染性由輔助噬菌體表達(dá)的完整PⅢ蛋白來(lái)提供。PⅢ蛋白很容易被蛋白水解酶水解，所以有輔助噬菌體超感染時(shí)，可以使每個(gè)噬菌體平均展示不到一個(gè)融合蛋白，即所謂“單價(jià)”噬菌體。

（2）PⅧ及其他展示系統(tǒng)。

PⅧ是絲狀噬菌體的主要外殼蛋白，位于噬菌體外側(cè)，C端與DNA結(jié)合，N端伸出噬菌體外，每個(gè)病毒顆粒有2 700個(gè)左右PⅧ拷貝[8-9]。PⅧ的N端附近可融合五肽，但不能融合更長(zhǎng)的肽鏈，因?yàn)檩^大的多肽或蛋白會(huì)造成空間障礙，影響噬菌體裝配[2，10-11]，使其失去感染力。但有輔助噬菌體參與時(shí)，可提供野生型PⅧ蛋白，降低價(jià)數(shù)，此時(shí)可融合多肽甚至抗體片段。 此外，尚有絲狀噬菌體PⅥ展示系統(tǒng)的研究報(bào)道[12]。PⅥ蛋白的C端暴露于噬菌體表面，可以作為外源蛋白的融合位點(diǎn)，可以用于研究外源蛋白C端結(jié)構(gòu)區(qū)域功能。從所掌握的文獻(xiàn)來(lái)看，該系統(tǒng)主要用于cDNA表面展示文庫(kù)的構(gòu)建，并取得了不錯(cuò)的篩選效果。

2.2 λ噬菌體展示系統(tǒng)

（1）PV展示系統(tǒng)。

λ噬菌體的PV蛋白構(gòu)成了它的尾部管狀部分，該管狀結(jié)構(gòu)由32個(gè)盤狀結(jié)構(gòu)組成，每個(gè)盤又由6個(gè)PV亞基組成。PV有兩個(gè)折疊區(qū)域，C端的折疊結(jié)構(gòu)域（非功能區(qū)）可供外源序列插入或替換。目前，用PV系統(tǒng)已成功展示了有活性的大分子蛋白β-半乳糖苷酶（465 ku）和植物外源凝血素BPA（120 ku）等[13]。λ噬菌體的裝配在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，故可以展示難以分泌的肽或蛋白質(zhì)。該系統(tǒng)展示的外源蛋白質(zhì)的拷貝數(shù)為平均1個(gè)分子/噬菌體，這表明外源蛋白質(zhì)或多肽可能干擾了λ噬菌體的尾部裝配。

（2）D蛋白展示系統(tǒng)。

D蛋白的分子質(zhì)量為11 ku，參與野生型λ噬菌體頭部的裝配。低溫電鏡分析表明，D蛋白以三聚體的形式突出在殼粒表面[13]。當(dāng)突變型噬菌體基因組小于野生型基因組的82%時(shí)，可以在缺少D蛋白的情況下完成組裝，故D蛋白可作為外源序列融合的載體，而且展示的外源多肽在空間上是可以接近的。病毒顆粒的組裝可以在體內(nèi)也可以在體外，體外組裝即是將D融合蛋白結(jié)合到λD-噬菌體表面，而體內(nèi)組裝是將含D融合基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入λD-溶源的大腸埃希菌菌種中，從而補(bǔ)償溶源菌所缺的D蛋白，通過(guò)熱誘導(dǎo)而組裝。該系統(tǒng)有一個(gè)很好的特點(diǎn)，噬菌體上融合蛋白和D蛋白的比例可以由宿主的抑制tRNA活性加以控制，這對(duì)于展示那些可以對(duì)噬菌體裝配造成損害的蛋白質(zhì)時(shí)特別有用。

2.3 T4噬菌體展示系統(tǒng)

T4噬菌體展示系統(tǒng)是20世紀(jì)90年代中期建立起來(lái)的一種新的展示系統(tǒng)。它的顯著特點(diǎn)是能夠?qū)煞N性質(zhì)*不同的外源多肽或蛋白質(zhì)，分別與T4衣殼表面上的外殼蛋白SOC（9 ku）和HOC（40 ku）融合而直接展示于T4噬菌體的表面，因此它表達(dá)的蛋白不需要復(fù)雜的蛋白純化，避免了因純化而引起的蛋白質(zhì)變性和丟失。T4噬菌體是在宿主細(xì)胞內(nèi)裝配，不需通過(guò)分泌途徑，因而可展示各種大小的多肽或蛋白質(zhì)，很少受到限制。吳健敏等成功地將大小約215 aa SOC/m E2融合蛋白展示于T4噬菌體衣殼表面[14]。令人值得關(guān)注的是，SOC與HOC蛋白的存在與否，并不影響T4的生存和繁殖。SOC和HOC在噬菌體組裝時(shí)可優(yōu)于DNA的包裝而裝配于衣殼的表面，事實(shí)上，在DNA包裝被抑制時(shí)，T4是雙股DNA噬菌體中*能夠在體內(nèi)產(chǎn)生空衣殼的噬菌體（SOC和HOC也同時(shí)組裝）。因此，在用重組T4做疫苗時(shí)，它能在空衣殼表面展示目的抗原，這種缺乏DNA的空衣殼苗，在生物安全性方面具有十分光明的前景[14]。

三、 噬菌體展示技術(shù)的局限性

（1）在噬菌體展示過(guò)程中必須經(jīng)過(guò)細(xì)菌轉(zhuǎn)化、噬菌體包裝，有的展示系統(tǒng)還要經(jīng)過(guò)跨膜分泌過(guò)程，這就大大限制了所建庫(kù)的容量和分子多樣性。目前，常用的噬菌體展示文庫(kù)中含有不同序列分子的數(shù)量一般限制在109。

（2）不是所有的序列都能在噬菌體中獲得很好的表達(dá)，因?yàn)橛行┑鞍踪|(zhì)功能的實(shí)現(xiàn)需要折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)、膜插入和絡(luò)合，導(dǎo)致在體內(nèi)篩選時(shí)需外加選擇壓力。例如，在噬菌體展示文庫(kù)試驗(yàn)中，由于部分未折疊的蛋白在細(xì)菌中很容易被降解，因此，必須小心控制條件，以保證在噬菌體表面展示的文庫(kù)沒(méi)有降解。另外，鼠源抗體在噬菌體中表達(dá)差，也是體內(nèi)選擇壓力的一個(gè)例子。真核細(xì)胞蛋白在細(xì)菌中表達(dá)差是因?yàn)樗鼈兊牡鞍踪|(zhì)合成與折疊機(jī)制不同的緣故[15]。

（3）噬菌體展示文庫(kù)一旦建成，很難再進(jìn)行有效的體外突變和重組，進(jìn)而限制了文庫(kù)中分子遺傳的多樣性。

（4）由于噬菌體展示系統(tǒng)依賴于細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)，所以，一些對(duì)細(xì)胞有毒性的分子如生物毒素分子，很難得到有效表達(dá)和展示。

四、結(jié)語(yǔ)

噬菌體展示技術(shù)經(jīng)過(guò)近20年的發(fā)展和完善，已成為生命科學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)重要技術(shù)，廣泛應(yīng)用于抗原抗體庫(kù)的建立、藥物設(shè)計(jì)、疫苗研究、病原檢測(cè)、基因治療、抗原表位研究及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究等[16]。噬菌體展示系統(tǒng)模擬了自然免疫系統(tǒng)，使我們有可能模擬體內(nèi)抗體生成過(guò)程，構(gòu)建高親和力抗體庫(kù)。由于噬菌體展示技術(shù)實(shí)現(xiàn)了基因型和表型的有效轉(zhuǎn)換，使研究者在基因分子克隆基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)構(gòu)象體外控制，從而為獲取具有良好生物學(xué)活性的表達(dá)產(chǎn)物提供了強(qiáng)有力手段。另外，噬菌體展示技術(shù)已成為不經(jīng)過(guò)免疫獲取特異性人源抗體的新途徑，為獲取對(duì)人類和動(dòng)物疾病有診斷和治療價(jià)值的單克隆抗體提供了重要手段。