GST融合蛋白的表達與純化原理

GST 純化系統(tǒng)是利用GST （glutathione-S-transferase ）融合蛋白與固定的谷胱甘肽（GSH）通過硫鍵共價親和，通過GSH交換洗脫的原理來進行純化 。1ml樹脂大約可結合5-8 mg融合蛋白，并可反復使用數次。試劑u IPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖苷） 2g IPTG 溶解入10ml 水，過濾除菌，分裝，-20℃保存。u Lysis buffer （50ml）1）2.5ml 1 M Tris，pH8.0 2）0.1ml 0.5ml EDTA 3）0.292g NaCl4）0.5ml Triton X-100 5）0.25ml 1M DTT u Elution buffer 1）0.615g glutathione 2）10 ml 1M Tris，pH8.0 3）90ml distilled water .

GST融合蛋白的表達與純化操作步驟

1）挑一個克隆至2ml LB液中（Amp+ ）

2）37℃振搖至OD600值約為0.6

3）將2ml菌液加入100 ml LB中

4）37℃振搖至OD600值約為0.6

5）加入IPTG至終濃度為1mM

6）繼續(xù)搖3～4h

7）離心（5000 rpm，5min，4℃）

8）用10×柱體積的lysis buffer懸浮細菌

9）超聲破碎細胞

10）離心（12,000rpm,15min,4℃），取上清

11）用濾紙過濾

12）加0.5 ml 50%谷胱甘肽瓊脂糖beads于層析柱

13）5×柱體積的lysis buffer洗層析柱

14）樣品過柱

15）5×柱體積的lysis buffer洗層析柱

16）3×柱體積的elution buffer洗脫蛋白

17）收集蛋白：0.5ml/管 18）取20ml樣品SDS-PAGE鑒定可以在buffer里增加點蛋白酶抑制劑，防止蛋白的降解。