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實(shí)驗(yàn)三十 顯微鏡直接計(jì)數(shù)法

來源:上海源葉生物科技有限公司   2010年03月31日 09:08  

一、基本原理
  利用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù),是一種常用的微生物計(jì)數(shù)方法。此法的優(yōu)點(diǎn)是直觀、快速。將經(jīng)過適當(dāng)稀釋的菌懸液(或孢子懸液)放在血球計(jì)數(shù)板載玻片與蓋玻片之間的計(jì)數(shù)室中,在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。由于計(jì)數(shù)室的容積是一定的( 0.1mm2),所以可以根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來換算成單位體積內(nèi)的微生物總數(shù)目。由于此法計(jì)得的是活菌體和死菌體的總和,故又稱為總菌計(jì)數(shù)法。
  血球計(jì)數(shù)板,通常是一塊特制的載玻片,其上由四條槽構(gòu)成三個平臺。中間的平臺又被一短橫槽隔成兩半,每一邊的平臺上各刻有一個方格網(wǎng),每個方格網(wǎng)共分九個大方格,中間的大方格即為計(jì)數(shù)室,微生物的計(jì)數(shù)就在計(jì)數(shù)室中進(jìn)行。血球計(jì)數(shù)板構(gòu)造如圖Ⅷ-1。
  計(jì)數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格,一種是一個大方格分成16個中方格,而每個中方格又分成25個小方格(圖Ⅷ-2);另一種是一個大方格分成25個中方格,而每個中方格又分成16個小方格(圖Ⅷ-1,C)。但無論是哪種規(guī)格的計(jì)數(shù)板,每一個大方格中的小方格數(shù)都是相同的,即16×25=400小方格,如圖Ⅷ-2。
  每一個大方格邊長為1mm,則每一大方格的面積為1mm2,蓋上蓋玻片后,載玻片與蓋玻片之間的高度為0.1mm,所以計(jì)數(shù)室的容積為0.1mm3。
  在計(jì)數(shù)時(shí),通常數(shù)五個中方格的總菌數(shù),然后求得每個中方格的平均值,再乘上16或25,就得出一個大方格中的總菌數(shù),然后再換算成1ml菌液中的總菌數(shù)。
  下面以一個大方格有25個中方格的計(jì)數(shù)板為例進(jìn)行計(jì)算:設(shè)五個中方格中總菌數(shù)為A,菌液稀釋倍數(shù)為B,那么,一個大方格中的總菌數(shù)
  因1ml=1cm3=1000mm3,
(即0.1mm3中的細(xì)菌總數(shù))=A*B*25/5
故1ml菌液中的總細(xì)菌數(shù)=A*25*10*1000*B/5  
            =50000A·B(個)
二、器材
  釀酒酵母菌懸液,血球計(jì)數(shù)板,顯微鏡,蓋玻片,無菌毛細(xì)管。
三、操作步驟
  1.稀釋
  將釀酒酵母菌懸液進(jìn)行適當(dāng)稀釋,菌液如不濃,可不必稀釋。
  2.鏡檢計(jì)數(shù)室
  在加樣前,先對計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室進(jìn)行鏡檢。若有污物,則需清洗后才能進(jìn)行計(jì)數(shù)。
  3.加樣品
  將清潔干燥的血球計(jì)數(shù)板蓋上蓋玻片,再用無菌的細(xì)口滴管將稀釋的釀酒酵母菌液由蓋玻片邊緣滴一小滴(不宜過多),讓菌液沿縫隙靠毛細(xì)滲透作用自行進(jìn)入計(jì)數(shù)室,一般計(jì)數(shù)室均能充滿菌液。注意不可有氣泡產(chǎn)生。
  4.顯微鏡計(jì)數(shù)
  靜止5分鐘后,將血球計(jì)數(shù)板置于顯微鏡載物臺上,先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)室所在位置,然后換成高倍鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。在計(jì)數(shù)前若發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀,需重新調(diào)節(jié)稀釋度后再計(jì)數(shù)。一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有5—10個菌體為宜。每個計(jì)數(shù)室選5個中格(可選4個角和*的中格)中的菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)。位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。如遇酵母出芽,芽體大小達(dá)到母細(xì)胞的一半時(shí),即作兩個菌體計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)一個樣品要從兩個計(jì)數(shù)室中計(jì)得的值來計(jì)算樣品的含菌量。
  5.清洗血球計(jì)數(shù)板
  使用完畢后,將血球計(jì)數(shù)板在水籠頭上用水柱沖洗,切勿用硬物洗刷,洗完后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干。鏡檢,觀察每小格內(nèi)是否有殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈,則必須重復(fù)洗滌至干凈為止。
四、實(shí)驗(yàn)報(bào)告
 

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