TGF2/Smads通路在肝癌的發(fā)病機(jī)制中占重要作用,核中磷酸化的Smad2P2Smad2的聚集可能對(duì)肝癌的發(fā)生發(fā)展有重要意義,Lin等人在研究乳腺癌中發(fā)現(xiàn)PPM1A磷酸酶可通過使核中磷酸化的Smad2的C末端SXSS去磷酸化來調(diào)節(jié)TGF2/Smads通路,從而也使大家對(duì)探索肝癌的發(fā)生機(jī)制及尋找新的有效治療靶點(diǎn)有了新的希望,PPM1A蛋白磷酸酶的有關(guān)研究成為焦點(diǎn),但因其抗體的不足,限制了研究進(jìn)展。在這里,我們利用PPM1A蛋白磷酸酶全長(zhǎng)原核表達(dá)質(zhì)粒制備特異性的鼠多克隆抗體,為研究PPM1A在肝癌或其他疾病中的生物學(xué)特性.
1.1　主要材料　異丙基22D硫代半乳糖苷IPTGNi2NTASpinColumn試劑盒抗組氨酸His6標(biāo)簽鼠單克隆抗體和HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG工作濃度分別為1∶1000和1∶5000;PPM1A鼠單克隆抗體工作濃度為1∶100;FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG為Picerce公司產(chǎn)品,工作濃度1∶100;DMEM培養(yǎng)基干粉胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司;氫氧化鋁佐劑pBEX12PPM1A2His原核表達(dá)質(zhì)粒,表達(dá)菌BL21（DE3）plysS及HepG2細(xì)胞均由本室保存;5～7周齡雌性Balb/c小鼠,
1.2　重組質(zhì)粒的原核表達(dá)　將含有pBEXPPM1A2His重組質(zhì)粒的BL21DE3plysS菌接種于5mLSOB液體培養(yǎng)基含100mg/L氨芐青霉素和35mg/L氯霉素,37℃振蕩培養(yǎng)12h后,按1∶100比例接種到200mLSOB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)4～6hA600nm=0.4～0.6時(shí),加入IPTG至終濃度為1.0mmol/L,37℃,250r/min誘導(dǎo)4h,同時(shí)空載體進(jìn)行同樣的轉(zhuǎn)化和誘導(dǎo)作為對(duì)照。
1.3　目的蛋白純化和復(fù)性　用Ni2NTA法純化蛋白,先將菌體沉淀按5mL/g的濕重混懸于預(yù)冷的裂解緩沖液中,反復(fù)凍融3次,然后超聲破菌,溶解物4℃,10000g離心20min,棄上清液,沉淀經(jīng)包涵體純化步驟后,沉淀溶于6mL尿素,按Qiagen公司的Ni2NTASpinColumn試劑盒說明書進(jìn)行目的蛋白的純化,并用SDS2PAGE電泳觀察純化效果。將純化所得蛋白用冷PBS透析復(fù)性。
1.4　目的蛋白的濃度及純度檢測(cè)　目的蛋白BL21DE3進(jìn)行SDS2PAGE電泳后,進(jìn)行蛋白條帶灰度掃描,用Gelwork1DadvancedV4.01軟件進(jìn)行純度分析。并用標(biāo)準(zhǔn)的Bradford檢測(cè)法測(cè)定目的蛋白的濃度。
1.5　目的蛋白Westernblot鑒定　按Westernblot操作步驟進(jìn)行?？站爸亟M質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌變性后經(jīng)SDS2PAGE分離,半干法轉(zhuǎn)印蛋白到硝酸纖維素膜上,用100mL/L的FCS/PBST4℃封閉過夜,加入*抗體鼠抗His抗體/鼠抗PPM1A單克隆抗體,37℃震蕩孵育1h,PBST漂洗3次,加入稀釋的第二抗體HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG,37℃震蕩孵育1h,PBST漂洗3次,加入ECL孵育,壓片曝光。
1.6　動(dòng)物免疫　將Ni2NTA純化回收并復(fù)性的目的蛋白350g溶于500L生理鹽水中,再與等體積的氫氧化鋁佐劑混合,按35μgII只的抗原劑量分別免疫9只Balb/c小鼠,背部皮內(nèi)多點(diǎn)注射。第14天和第28天各加強(qiáng)免疫1次,加強(qiáng)免疫的方法和抗原劑量同上。第35天摘小鼠眼球取血,靜置離心后分離血清,4℃保存。
1.7　抗體滴度檢測(cè)　參照文獻(xiàn)[3]的ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)。即用Ni2NTA法純化所得的PPM1A2His融合蛋白目的抗原按10g/mL、1g/mL和0.1g/mL的梯度,包被ELISA板100L/孔,4℃孵育過夜,用新配制的PBST洗液洗5次,50g/LBSA每孔200μL封閉后,加入用10mL/LFBS/PBS稀釋的不同梯度的免疫小鼠血清抗體按1∶100、1∶1000、1∶10000、1∶100000、1∶1000000）,37℃孵育1h,PBST洗5次,加1∶5000稀釋的酶標(biāo)二抗HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG,37℃孵育60min,PBST洗5次,以四甲基聯(lián)苯胺TMB2過氧化氫系統(tǒng)為底物37℃顯色5min后,終止,酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔吸光度值。同時(shí)以正常鼠血清為陰性對(duì)照及PBS為一抗空白。
1.8　多克隆抗體特異性檢測(cè)　①免疫組織化學(xué)檢測(cè):利用PPM1A多克隆抗體1∶800稀釋檢測(cè)人肝癌組織PPM1A的表達(dá),按DAKOEnvision法試劑盒說明書操作,DAB法顯色,以正常小鼠血清和PBS分別作為陰性對(duì)照和空白對(duì)照。②免疫熒光檢測(cè):24孔板中用含100mL/L新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%～90%融合,用PBS洗3次,用冷500mL/L甲醇固定15min,1mL/LTritonX2100室溫處理10min,100mL/L正常羊血清室溫封閉20min,加入PPM1A多克隆抗體血清1∶50,對(duì)照組加入同樣稀釋的未經(jīng)免疫的小鼠血清,4℃孵育過夜,PBS洗3次,加入FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗1∶100,37℃,避光孵育30min,PBS洗3次后用熒光顯微鏡觀察并記錄。