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ELI-SPOT 及其應用

來源:北京博蕾德生物科技有限公司   2013年06月17日 09:30  

一、            原理
ELI-SPOT,即斑點ELISA,是利用酶標板作反應容器進行的酶聯免疫反應。其基本原理與ELISA相同。首先用捕獲抗體包被反應板,封閉后,依次加入待檢標本、生物素化檢測抗體、鏈霉菌抗生物素蛋白-堿性磷酸酶及底物,陽性結果出現斑點顯色,利用倒置顯微鏡進行斑點計數。其優勢在于可在與體內(活體條件)極接近的條件下,在體外對細胞分泌成分(如細胞因子、Fas等)進行追蹤研究。
幾點說明:
l        反應板:ELI-SPOT所用的反應板可以是PVDF膜包被好的,也可以是普通酶標板。如用普通酶標板,需用特制的瓊脂糖底物溶液。因此,ELI-SPOT又可分為PVDF法和瓊脂糖法。
l        待檢標本須制成單細胞懸液,細胞經適當誘導劑刺激后產生相應的因子。
l        細胞誘導方法:細胞誘導可分為直接法和間接法。如果細胞誘導過程是在抗體包被的反應孔內進行的,即為直接法;如果細胞誘導過程是在24孔板或燒杯中進行的,即為間接法。采用直接法還是間接法取決于以下幾個方面:?待分析細胞的類型。‚預期的能分泌細胞因子的細胞數。如果預期的可分泌細胞因子的細胞量少,建議使用直接法;如果可分泌細胞因子的細胞量特別高,用間接法。
l        誘導劑及誘導時間的選擇:與待檢因子種類相關,參照下表(廠家提供,僅供參考)
待檢因子
樣本來源
誘導劑
誘導時間
檢測用細胞量
Human IL-2
PBMC
PMA, Ionomycin
10-15 hours
5x104-1x105
Human IL-4
CD4+ T細胞
PMA, Ionomycin
10-15 hours
2x105-2.5x105
Human IL-6
PBMC
LPS
10-15 hours
1x104-2.5x104
Human IL-10
PBMC
LPS
20-24 hours
2x105-2.5x105
Human IL-12
PBMC
LPS
Overnight
1x105-2.5x105
Human IFN-γ
PBMC
PMA, Ionomycin
10-15 hours
2x104-5x104
Human TNF-α
PBMC
LPS
10-15 hours
2x104-4x104
Human Fas L
PBMC
Anti-human CD3
(B-B11), IL-2,
/ PMA,Ionomycin
3days,10-15 hours
3x105-4x105
Murine IFN-γ
PBMC
PMA, Ionomycin
10-15 hours
2x104-5x104
Rat IFN-γ
PBMC
PMA, Ionomycin
10-15 hours
2x104-5x104
Rat TNF-α
Rat splenocyte
LPS
10-15 hours
2x104-4x104
 
二、            ELI-SPOT 操作步驟
APVDF
1. 96孔PVDF包被板經70%已醇處理后,用捕獲抗體進行包被。
2. 單細胞懸液(含適當誘導劑)加入反應孔內,孵育(直接法);如用間接法,細胞在24孔板或燒杯中誘導后,取適量誘導過的細胞懸液加入到反應孔內。
3. 倒掉細胞,加入生物素化檢測抗體,孵育。
4. 加鏈霉菌抗生物素蛋白堿磷酶。
5. 加入BCIP/NBT底物,形成斑點。
B:瓊脂糖法
1. 用捕獲抗體包被酶標板。
2. 單細胞懸液(含適當誘導劑)加入反應孔內,孵育(直接法)。如用間接法,細胞在24孔板或燒杯中誘導后,取適量誘導過的細胞懸液加入到反應孔內。
3. 倒掉細胞,加入生物素化檢測抗體,孵育。
4. 鏈霉菌抗生物素蛋白堿磷酶。
5. 加入瓊脂糖底物溶液,形成斑點。
 
三、            ELI-SPOT 檢測單細胞分泌細胞因子的意義
細胞因子是一類由白細胞和其它一些細胞產生的,可在細胞間進行信息傳遞。大多數細胞因子是生長或分化調節因子,通常在造血系統中發揮作用,同時發現其在腦、肌肉和內分泌器官間也存在相互作用,另外,還能誘導細胞凋亡。在一些疾病中,如急性炎癥、血液病、癌癥和自身免疫性疾病中可常見細胞因子的異常表達。
在單細胞水平進行細胞因子的監測提供了zui接近“原位”環境的,即zui接近體內條件,觀察細胞因子產生的方法。這正是ELI-SPOT方法的特性。它可使科研工作者在體外進行與體內環境相似的研究。利用這一方法,可跟蹤細胞因子的產生、跟蹤疾病進展、調整臨床治療策略、防止病情惡化以及致命后果的發生。
 
四、            ELI-SPOT應用
1. 在自身免疫腦脊髓炎疾病研究中,給大鼠注射干擾素β后,可顯著隆低可產生干擾素γ的細胞的數量。(1)
2. 進行免疫基因肽疫苗的評價。(2)
3. 接種途徑效果的評估。(3)
4. 研究TH1/TH2 T細胞產生細胞因子的方式以及由一個亞群向另一個亞群轉換的情況。(4,5)
5. 成功檢測黑色素瘤中腫瘤活性T細胞數量。(6)
6. 用于重癥肌無力患者外周血IFN-γ、IL-10分泌性T細胞的研究。(7)
 
五、            參考文獻:
1. Ruuls, S.R. et al., 1996  J. Immunol. 157:5721
2. Kulane, A. et al., 1997  Acta Tropica. 68:37
3. Ibsen, M. W. et al., 1997  Scand. J. Immunol. 46:274
4. Gabrielsson, S. et al., 1997  Allergy. 52:860
5. Elaghazali, G. et al., 1997  Clin. Exp. Immunol. 109:84
6. Scheibenbogen, C. et al. 1997  Int. J. Cancer 71:932
7. 侯世芳,閆曉波,王維治,1999  第六屆全國神經免疫學術研討會論文匯編
 

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