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DEAE-Sephadex A-50柱層析純化免疫球蛋白

來源:北京博蕾德生物科技有限公司   2013年06月13日 14:08  

(一) 原理

  DEAE-SephadexA-50(二乙基氨基乙基-葡聚糖A-50)為弱堿性陰離子交換劑。用NaOH將CL-型轉變為OH-型后,可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白屬于中性蛋白(等電點為PH6.85~7.5),其余均屬酸性蛋白。在PH7.2~7.4的環境中,酸性蛋白均被DEAE-Sephadex A-50吸附,只有γ球蛋白不被吸附。因此,通過柱層析γ球蛋白便可在洗脫中先流出,而其他蛋白則被吸附在柱上,從而便可分離獲得純化的IgG。DEAE-sephadexA-50柱層析是離子交換層析的一種。

  (二)試劑和器材

  1、試劑:

  (1)鹽析提取的人γ球蛋白;

  (2)0.5N NaOH,0.5N HCl 2M NaCl,10%NaN3;

  (3)DEAE-Sephadex A-50,聚乙二醇(PEG);

  (4)0.1M, PH7.4 PB(配制見鹽析部分);

  2、器材:

  (1)層析玻璃柱(1.3×40cm),滴定鐵架,自由夾,螺旋夾,尼龍紗(200目);

  (2)普通冰箱,751桮型紫外分光光度計,電導儀、抽濾裝置(包括抽氣機、干燥瓶、布氏漏斗、橡皮墊圈、抽濾瓶),PH計;

  (3)透析袋、座標紙、濾紙、PH精密試紙;

  (4)量筒、燒杯、試管、吸管、滴管、滅菌小瓶等。

  (三) 操作步驟

  1、DEAE-Sephadex A-50預處理

  稱DEAE-Sephadex A-50(下稱A-50)5克,懸于500ml蒸餾水,1小時后傾去上層細粒。按每克A-50加0.5N NaOH 15ml的比例,將A-50浸泡于0.5N NaOH中,攪勻,靜置30分鐘,裝入布氏漏斗(墊有2層濾紙)中抽濾,并反復用蒸餾水抽洗至PH呈中性;再以0.5N HCl同上操作過程處理,zui后以0.5N NaOH再處理一次。處理完后,將A-50浸泡于0.1M,PH 7.4 PB中過夜。

  2、裝柱

  (1)將層析柱垂直固定于滴定鐵架上,柱底墊一園尼龍紗,出水口接一乳膠或塑料管并關閉開關。

  (2)將0.1M,PH7.4 PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度,再倒入經預處理并以同上緩沖液調成稀糊狀的A-50。待A-50凝膠沉降2-3cm厚時,啟開出水口螺旋夾,控制流速1ml/分鐘,同時連續倒入糊狀A-50凝膠至所需高度。

  (3)關閉出水口,待A-50凝膠*沉降后,柱面放一園形濾紙片,以橡皮塞塞緊柱上口,通過插入橡皮塞之針頭及所連接的乳膠或塑料管與洗脫液瓶相連接。

  3、平衡:啟開出水口螺旋夾,控制流速12-14滴/分鐘,使約2倍床體積的洗脫液流出。并以PH計與電導儀分別測定洗脫液及流出液之PH值與離子強度是否相同。達到一致時關閉出水口,停止平衡。

  4、加樣及洗脫:

  啟開上口橡皮塞及下口螺旋夾,使柱中液體緩慢滴出,當柱面液體與柱面相切時,立即關閉出水口,以毛細滴管沿柱壁加入樣品(體積應<床體積的2%,蛋白濃度以<100mg為宜)。松開出水口螺旋夾使柱面樣品緩慢進入柱內,至與柱面相切時,立即關閉下口,以少量洗脫液洗柱壁2-3次;再放開出水口,使洗液進入床柱,隨后立即于柱面上加入數ml洗脫液,緊塞柱上口,使整個洗脫過程成一密閉系統。并控制流速12~14滴/分鐘。

  5. 收集:開始洗脫的同時就以試管進行收集。每管收集3~5ml。共收集10~15管。

  6. 測蛋白:以751-G型紫外分光光度計分別測定每管OD280nm,與OD260nm,按前述公式計算各管蛋白含量。并以OD280nm為縱座標,以試管編號為橫座標,繪制洗脫曲線。

  7. 合并、濃縮:將洗脫峰的上坡段與下坡段各管收集液分別進行合并,以PEG(MW6000)洗縮至所需體積,加入0.02%NaN3防腐劑,于4℃保存備用。

  8. A-50凝膠的再生:在柱上先以2M NaCl洗柱上的雜蛋白至流出液的OD280nm<0.02,再以蒸餾水洗去柱中鹽。然后按預處理過程將A-50再處理一遍即達再生。近期用時泡于洗脫緩沖液中4℃保存;近期不用時,以*洗2次,再置50℃溫箱烘干,裝瓶內保存。

  (四) 注意事項

  1. 柱的選擇:從理論上說,只要柱足夠長,就得獲得理想的分辨率,但由于層析柱流速同壓力梯度有關,柱長增加使流速減慢,峰變寬,分辨率降低。柱的直徑增加,使液體流動的不均勻性增加,分辨率明顯下降。

  2. 純化過程必須嚴格控制脫緩沖液的PH及離子強度。樣品與A-50凝膠必須用洗脫緩沖液*平衡后,才能進行柱層析。

  3. 所裝的柱床必須表面平整,無溝流及氣泡,否則應重裝。

  4. 洗脫過程中應嚴格控制流速,且勿過快。

  5. 上樣的體積要小,濃度不宜過高。

  6. 加樣及整個洗脫過程中,嚴防柱面變干。

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