核被膜(nuclear envelope)是包被核內含物的雙層膜結構,作為界膜,它把細胞核與細胞質分開,有利于穩定基因的結構,外核膜與胞質中的粗面內質網相鄰,外表亦有核糖體附著,內核膜附著有一層纖維狀蛋白網,該結構對內膜具有支撐作用。核間隙與粗面內質網腔相通,內含多種蛋白質和酶,核膜還控制著細胞核與細胞質之間的物質交換。
分離核膜幾乎都以肝臟為原料,但不同類型的研究用不同的制備方法,有些方法適合于膜組成的研究,有些方法適合于酶與通透性研究。基本上分為低離子強度和高離子強度法。高離子濃度法用高濃度的陽離子使膜破裂,該方法能獲得較高產量的膜。低離子濃度法可使膜具有形態完整并保留的酶活性高。Kaufmann等用高離子強度介質快速從鼠肝細胞核中分離完整核膜,幾乎不受污染,對研究核基質和核被膜間的關系非常有用。Fraser等用DNase處理染色體分離核被膜碎片,染色體污染少。
本文講述用高速冷凍離心機進行核膜的亞分級分離的方法和步驟。
1. 把核被膜(大約1~2mg蛋白質)懸浮在5ml冰冷的10mmol/L三乙醇胺-HCl、0.1mmol/L蔗糖(pH=7.5)中,再加入0.5ml 20%(體積分數) Triton X-100,在0℃孵育10分鐘。
2. 該懸浮液,在45000gmax離心,使核被膜沉降。
3. 把沉淀重新懸浮在5mL相同的緩沖液里(不加去垢劑),再加入5ml 100mmol/L 三乙醇胺-HCl、2.0mol/L NaCl。
4. 在0℃孵育10分鐘后,懸浮液再發步驟2離心,沉淀是管孔復合體疊層膜。
在所有步驟中,勻漿重懸是基本步驟,在往沉淀里加2~3滴甘油搖動或手工勻漿。用1%(質量濃度)檸檬酸(1ml/mg核蛋白)抽提細胞核來制備外核膜,通過低速離心上清液在120000gmax離心(6*14ml甩開轉子,26500r/min)、4℃離心1小時來沉淀膜。
湖南湘立研制生產的幾款醫用離心機可以用來進行細胞分離,如DL5M/TDL5M兩種型號的低速冷凍離心機可用來進行干細胞實驗。XL03RH型控溫離心機(低速冷凍離心機)可用來進行溫度敏感型人體細胞分離。
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