1、分離制備單細(xì)胞懸液：

（1）體外培養(yǎng)的細(xì)胞株：用胰酶消化，zui后用PBS懸浮吹打成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞要計(jì)數(shù)，具體的量我前邊已經(jīng)說過。

（2）體內(nèi)臟器細(xì)胞：處死動物，取出臟器，于Hanks’液中制備成單個細(xì)胞懸液。

2、膠板制備：

（1）取100μl于45℃水浴中保溫的0.5%NMA，鋪于磨沙載玻片上，形成底膠。蓋玻片推勻，不能有氣泡，4度凝固5至8分鐘。

（2）水平取下蓋片，取100μl于37℃水浴中保溫的0.5%LMA與20μl細(xì)胞懸液（約400個細(xì)胞）混勻，立即鋪片，加上蓋玻片，4度凝固5至8分鐘。

3、細(xì)胞裂解與電泳：

（1）將制備好的膠板去掉蓋玻片后，浸于4℃預(yù)冷的細(xì)胞裂解液中，在4℃下裂解2.5到3小時。

（2）取出膠板，用雙蒸水浸沒漂洗后放入電泳槽中，浸泡在4℃預(yù)冷的電泳液中解旋20分鐘。

（3）玻片水平放置陽附近，4℃電泳20到25分鐘（25V，300mA）。可在電泳槽周圍加冰塊以保持低溫。

4、中和與染色：

（1）電泳結(jié)束，將膠板浸泡于中和液中，每次10分鐘，共中和3次，每次要更換中和液。zui后晾干。

（2）取出膠板，置于染色缸中，在2μg/ml的EB染色液中，暗處染色5到10分鐘。

（3）蒸餾水漂洗2次，每次5分鐘。

稍晾干，濾紙吸去多余水分，盡快在熒光顯微鏡下觀察。

注意事項(xiàng)：

1.細(xì)胞一定要消化成單個的，如果你養(yǎng)的細(xì)胞是懸浮生長的，或者形狀是圓形的（例如hela），那么你可以直接用細(xì)胞刮收細(xì)胞做，否則，如果細(xì)胞是非圓形的，例如成纖維細(xì)胞等，一定要用胰酶消化，使之成圓形，然后才可做實(shí)驗(yàn)。很多做彗星實(shí)驗(yàn)總是出不來結(jié)果的，可以考慮下是否是這方面的原因。

2.電泳時，電流與電壓強(qiáng)度在每次實(shí)驗(yàn)時要恒定（例如：20V，200mA恒定），這樣出來的慧尾才有分析價值，否則你不知道分析因素的差異是由電泳條件的改變引起的還是細(xì)胞處理不同引起的。

3.關(guān)于掉膠的問題：蓋玻片兩面都涂上剝離硅烷（挺便宜的一大瓶，但是有毒），這樣會好很多

4.裂解液是整個實(shí)驗(yàn)中zui關(guān)鍵的因素，裂解液zui終使用時必須是澄清沒有任何沉渣的，如果沒有溶解好是肯定影響實(shí)驗(yàn)的，如果常溫不容易溶解的話可以放入4℃冰箱中一段時間，就比較容易溶解了

小結(jié)：本實(shí)驗(yàn)所有操作步驟從膠板制備開始到zui后都應(yīng)該在暗光或者紅光下操作，實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟是凝膠制備，一定要均勻平整無氣泡，此外要避免試驗(yàn)中細(xì)胞裂解液等有毒物質(zhì)對自己的傷害。