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技巧;醋酸纖維膜電泳詳細(xì)說明

來源:上海士鋒生物科技有限公司   2013年04月12日 09:42  


醋酸纖維膜電泳是一項(xiàng)簡(jiǎn)便而又迅速的方法。它的優(yōu)點(diǎn)是:①電泳區(qū)帶分離清楚,比瓊脂平板電泳分辨率高;②可以定量;③樣品用量少,只需要幾微升即可。

(一)材料與試劑

1.pH8.6離子強(qiáng)度0.05巴比妥緩沖液

2.0.5%氨基黑染色液

3.透明液:冰醋酸 3 份 ;95%乙醇 2 份 混合即可

4.醋酸纖維膜

(二)操作方法

1.將醋酸纖維膜條浸于巴比妥緩沖液中,浸透后用竹鑷子夾到濾紙上,吸去過多的水分。將膜的光滑面向下搭在電泳槽兩側(cè)的濾紙橋上,注意搭平。

2.加樣 用微量加樣器于負(fù)1.5cm處加樣1µl~3µl,注意樣品要成一條直線且垂直方向。也可用血球計(jì)數(shù)板蓋玻片蘸取樣品輕輕點(diǎn)上。

3.電泳 電壓10V/cm~15V/cm或0.4mA/cm~0.6mA/cm電泳45min~60min,至電泳區(qū)帶展開約2.5cm~3.5cm時(shí),關(guān)閉電源。

4.染色 將膜浸于氨基黑染色液中,染色數(shù)分鐘。

5.透明 將染色的醋酸纖維膜浸于透明液中,漂洗5min ~10min,至背景呈乳白色為止。為了防止膜上出現(xiàn)許多氣泡,可以逐漸升高透明液濃度10%、20%以至30%。

6.結(jié)果觀察及保存 透明后,將膜貼于玻璃上,干后取下,即可觀察結(jié)果并保存。

7.定量 將各區(qū)帶剪下,分別浸于4Mol/L NaOH 4ml中,振搖數(shù)次,約2h,色澤被浸出,于580nm~620nm比色,測(cè)出各區(qū)帶的OD值。同時(shí)剪一塊大小相似無蛋白的透明膜同樣處理,做為對(duì)照。

計(jì)算各區(qū)帶蛋白含量百分比(以血清為例)

總OD值T=A α1 α2 β γ

白蛋白%=A/T×100%

以此類推。

(三)注意事項(xiàng)

1.醋酸纖維膜孔隙小,含水量少,且較薄,因此它對(duì)熱很敏感,故應(yīng)注意控制電壓、電流。

2.樣品不可過多,只需幾微升即可。

3.加樣一定要呈直線、垂直、分布均勻,這樣泳動(dòng)的區(qū)帶整齊、不歪。

4.注意醋酸纖維膜的質(zhì)量,浸泡很久仍有大塊白色硬點(diǎn)者可棄之不用。
 

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