同種細胞在培養(yǎng)時2個靠在一起的細胞自發(fā)合并,稱自發(fā)融合;異種間的細胞必須經誘導劑處理才能融合,稱誘發(fā)融合。
仙臺病毒法融合
①兩種細胞在一起培養(yǎng),加入病毒,在4℃條件下病毒附著在細胞
膜上。并使兩細胞相互凝聚;
②在37℃中,病毒與細胞膜發(fā)生反應,細胞膜受到破環(huán),此時需
要Ca2+和Mg2+,zui適PH為8.0一8.2;
②細胞膜連接部穿通,周邊連接部修復,此時需Ca2+和ATP;
④融合成巨大細胞,仍需ATP 。
聚乙二醇(PEG)法
聚乙二醇(PEG)結構為:HOH2C(CH20CH2)nCH2OH,分子量大于200小于6000者均可用作細胞融合劑。PEG經高壓滅菌后,與溫熱的Engle氏液混合。通常用分子量低于1000的PEG作融合劑,50%PEG溶液能產生zui多雜交細胞。PEG溶液在pH6.0時細胞融合率zui高。
電融合法
在直流電脈沖的誘導下,細胞膜表面的氧化還原電位發(fā)生改變,使異種細胞粘合并發(fā)生質膜瞬間破裂,進而質膜開始連接,直到閉和成完整的膜,形成融合體。
優(yōu)點:融合率高、重復性強、對細胞傷害小;
裝置精巧、方法簡單、可在顯微鏡下觀察或錄像觀察融合過程;
免去PEG誘導后的洗滌過程、誘導過程可控性強。
融合誘導物
細胞融合的誘導物種類很多.常用的主要有生物法用滅活的仙臺病毒(Sendai virus),化學法如用聚乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)和物理法如電脈沖。目前應用zui廣泛的是聚乙二醇,因為它易得、簡便,且融合效果穩(wěn)定。PEG的促融機制尚不*清楚,它可能引起細胞膜中磷脂的酰鍵及極性基團發(fā)生結構重排。動植物細胞融合方法不同,生物法利用滅活仙臺病毒是動物細胞融合所*的。
自發(fā)條件下或人工誘導下, 兩個不同基因型的細胞或原生質體融合形成一個雜種細胞。基本過程包括細胞融合導致異核體(heterokaryon)的形成, 異核體通過細胞有絲分裂導致核的融合, 形成單核的雜種細胞。有性生殖時發(fā)生正常的細胞融合, 即由兩個配子融合成一個合子。
細胞融合不僅可用于基礎研究,而且還有重要的應用價值,在植物育種方面已經成功的有蘿卜+甘藍、粉藍煙草+郎氏煙草、番茄+馬鈴薯等等。細胞融合另一個重要應用就是制備單克隆抗體,單克隆抗體可以用作診斷試劑,治療疾病和運載藥物,具有準確,,簡易,快速等優(yōu)點。
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