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封閉劑在細胞免疫熒光中的應用步驟

來源:上海士鋒生物科技有限公司   2013年04月07日 09:47  

I、步驟:

一、固定:

PBS 5min×3次 振蕩洗滌制作好的細胞爬片。

固定液覆蓋細胞,RT 靜置15min。

PBS 5min×3次 振蕩洗滌。

二、通透化:

通透液覆蓋細胞,RT 靜置30min。

PBS 5min×3次 振蕩洗滌。

三、封閉:

封閉液覆蓋標本表面37℃孵育1h。

四、一抗孵育:

一抗以合適濃度稀釋PBS,覆蓋標本表面。

4℃孵育過夜,第二天37℃復溫1h。

PBS 5min×3次 振蕩洗滌。

五、二抗孵育:

FITC標記二抗以合適濃度稀釋于PBS,覆蓋標本表面。

37℃避光孵育<60min。

PBS 5min×3次 避光 振蕩洗滌。

六、染核:

新鮮稀釋Hoechst覆蓋細胞表面,RT避光靜置<10min。

PBS 5min×3次 避光 振蕩洗滌。

七、封片:

在干凈的載玻片上滴一滴封片劑,將爬片的細胞面扣在封片劑上。

八、鏡檢,4℃避光保存。

II、注:

1、細胞密度要合適,狀態較好。

2、從孵育二抗開始要避光(關閉室內日光燈即可)。

3、完成后及時鏡檢,照相;分別用不同波長激發熒光,在Photoshop軟件下合成一張圖。

III、試劑配制:

1、固定液:4%多聚甲醛/PBS:

4g多聚甲醛,50~80mlPBS,加熱至60℃,持續攪拌至*溶解,(通常需滴加少許1n NaOH才能使溶液清亮),定容100ml,RT保存。

2、通透液:0.5 %(v/v)TritonX-100/PBS

3、封閉液:正常山羊血清稀釋于PBS;或商品化封閉液成品。

4、Hoechst:Hoechst33258即可。

5、封片劑:50%(v/v)甘油/PBS。

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