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超氧化物檢測試劑盒

來源:上海索寶生物科技有限公司   2009年12月30日 09:22  

 

超氧化物檢測試劑盒
規格:100次
產品簡介:
Ø 超氧化物檢測試劑盒(Superoxide Assay Kit)是一種用于超氧化物快速高靈敏度檢測的試劑盒。
Ø 本試劑盒利用超氧化物可以還原WST-1產生可溶性有色物質為基礎來檢測超氧化物。本試劑盒的檢測試劑中添加了Catalase(觸酶)等,可以清除過氧化氫等過氧化物對WST-1顯色的干擾,使測定結果更加準確。并且本試劑盒還提供SOD(超氧化物歧化酶),可以驗證本試劑盒測定出的結果是否為超氧化物,以排除檢測體系中所用的一些試劑可能產生的干擾。對于本試劑盒,加入SOD后通常可以抑制90%以上的超氧化物。 
Ø WST-1是一種類似于MTT的化合物,可以被超氧化物還原生成橙色的formazan。超氧化物產生越多越快,則顏色越深,即相應測定得到的吸光度值越大。   
Ø 使用WST-1作為檢測試劑比用傳統的細胞色素c(cytochrome c)檢測超氧化物具有多方面的優點。首先,WST-1本身的吸光度非常低(通常OD450為0.02左右,因儀器和酶標板不同而有所不同),而細胞色素c本身的吸光度非常高(通常OD550為0.5左右),因此,使用WST-1與細胞色素c相比,檢測靈敏度高很多倍。其次,WST-1的還原產物是穩定的可溶性產物,且對細胞基本無毒性,使WST-1方法更加適合于高通量的篩選。另外,細胞色素c法由于靈敏度的限制,一般不適合用96孔板測定,而WST-1法可以用96孔板測定,使檢測更加便捷。用WST-1法或細胞色素c法對超氧化物測定效果比較參考圖1。圖1中,50萬/毫升嗜中性粒細胞在37℃用PMA刺激時間,用WST-1或細胞色素c方法分別測定。WST-1法測定OD450,而細胞色素c法測定OD550。另外,WST-1法和luminol法相比,靈敏度相近,但僅須使用普通的酶標儀,無須使用luminol法所需的luminometer,并且檢測速度也比luminol 圖1. WST-1法和細胞色素c法對于法更加快捷。 超氧化物測定效果的比較。
Ø 超氧化物通常指超氧化物陰離子(superoxide anion)O2·-,是一種氧分子的自由基。在呼吸鏈中,NADPH氧化酶把電子傳遞給氧分子的時候,就會產生超氧化物陰離子)O2·-。 超氧化物陰離子)O2·-是一種強氧化劑,可以由被刺激的白細胞等產生,從而抵御微生物的感染等。超氧化物陰離子)O2·-也可以導致氧化損傷,和許多疾病的發生密切相關。
Ø 本試劑盒可以測定100個樣品。
包裝清單:
產品編號  產品名稱            包裝
S0060-1  超氧化物檢測緩沖液 30 ml 
S0060-2   WST-1溶液         1 ml 
S0060-3   Catalase溶液        200微升 
S0060-4   SOD溶液           20微升 
— 說明書 1份
保存條件:
-20℃保存,一年有效。
注意事項:
Ø WST-1溶液、Catalase溶液和SOD溶液均宜盡量避免反復凍融,可以適當分裝。
Ø 為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。
使用說明:
1. 超氧化物檢測工作液的配制:
按照下表比例配制超氧化物檢測工作液:
1個檢測   5個檢測 10個檢測  20個檢測   50個檢測 
超氧化物檢測緩沖液 200微升    1毫升    2毫升      4毫升   10毫升 
WST-1溶液          10微升   50微升  100微升    200微升 500微升 
Catalase溶液        2微升    10微升  20微升    40微升 100微升 
超氧化物檢測工作液 212微升 1.06毫升   2.12毫升  4.24毫升 10.6毫升 
2. 懸浮細胞產生超氧化物的檢測:
a. 細胞用PBS、Hanks液或生理鹽水洗滌一次。 
b. 約按5-10萬個細胞/毫升的比例,用超氧化物檢測工作液懸浮細胞。
c. 在96孔板中,每孔加入200微升用超氧化物檢測工作液懸浮的細胞,每孔約1-2個細胞。
d. 37℃孵育3分鐘。
e. 在預定的檢測孔中加入預計可以誘導產生超氧化物的刺激物,如PMA等,刺激10-60分鐘或其它預定的時間。須至少留一個不加刺激物的孔作為空白對照。選擇1-2個加刺激物的孔中加入2微升SOD以驗證整個檢測體系,加SOD溶液的檢測可以不做。試劑盒提供的SOD溶液足夠做10個檢測。具體檢測時的安排參考下表: 
細胞 超氧化物檢測工作液 刺激物 SOD溶液 
空白對照 +                               - 
待測樣品 +                               - 
陰性對照 +                               + 
f. 在450nm測定吸光度。如無450nm濾光片,可以使用420-480nm的濾光片。可以使用大于600nm的波長作為參考波長進行雙波長測定。
3. 貼壁細胞產生超氧化物的檢測:
a. 約按每孔5000-10000個細胞(具體的細胞接種數量須根據細胞的大小和生長速度自行確定)把細胞培養到96孔板中,使第二天或待檢測時細胞為80-90%滿。 
b. 吸去培養液,用PBS、Hanks液或生理鹽水洗滌一次。
c. 每孔加入200微升超氧化物檢測工作液,37℃孵育3分鐘。
d. 在預定的檢測孔中加入預計可以誘導產生超氧化物的刺激物,如PMA等,刺激10-60分鐘或其它預定的時間。須至少留一個不加刺激物的孔作為空白對照。選擇1-2個加刺激物的孔中加入2微升SOD以驗證整個檢測體系,加SOD溶液的檢測可以不做。試劑盒提供的SOD溶液足夠做10個檢測。具體檢測時的安排參考下表: 
細胞 超氧化物檢測工作液 刺激物 SOD溶液
空白對照 +                     -        
待測樣品 +                             
陰性對照 +                              + 
e. 在450nm測定吸光度。如無450nm濾光片,可以使用420-480nm的濾光片。可以使用大于600nm的波長作為參考波長進行雙波長測定。

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