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考馬斯亮蘭法(Bradford法)蛋白定量試劑盒說明

來源:上海滬峰化工有限公司   2013年03月08日 10:30  

 

 
說明:考馬斯亮蘭法(Bradford 法),是目前靈敏度zui高的蛋白質(zhì)測(cè)定法之一。考馬斯亮蘭
G-250 染料,在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合,使染料的zui大吸收峰由 465nm 變?yōu)?595nm,溶
液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。在595nm 下測(cè)定的吸光度值A(chǔ)595,與蛋白質(zhì)濃度成正比。
包裝:
考馬斯亮蘭溶液 300 毫升
蛋白標(biāo)準(zhǔn)(BSA ) 10 毫升(1mg/ml)
產(chǎn)品說明書 1 份
保存: 2℃-8 ℃ (BSA 蛋白標(biāo)準(zhǔn)-20℃)
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 從冰箱取出考馬斯亮蘭溶液,平衡至室溫并混勻;預(yù)熱分光光度計(jì)20 分鐘或酶標(biāo)儀。
2. 以分光光度計(jì)測(cè);準(zhǔn)備九支管,分別編號(hào),按下列順序加樣。
編號(hào) 1 2 3 4 8 6 7 8 9
去離子水μl 100 90 80 60 40 20 0
蛋白標(biāo)準(zhǔn)μl 0 10 20 40 60 80 100
樣品μl 100 100
考馬斯亮蘭溶液ml 3 3 3 3 3 3 3 3 3
混勻、,2~5分鐘后,以第1 號(hào)試管為空白對(duì)照595nm,測(cè)定各樣品收值A(chǔ)595,樣品管8、
9 取平均值
相當(dāng)濃度mg/ml 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
注:樣品和試劑比可以按比例放大或縮小。
微孔檢測(cè)時(shí),可以按比例縮小,但總體積不小于100ul。
性能指標(biāo):
在20~1200ug/ml 有著比較好的線性。當(dāng)吸光度大于0.8A 時(shí),請(qǐng)把樣本稀釋后再做。
注意:
1.使用塑料或玻璃比色皿。如使用石英比色皿,使用后立即用少量95%的乙醇蕩洗,以
洗去染色用完后
可以乙醇反復(fù)清洗。塑料比色皿決不可用乙醇或丙酮長(zhǎng)時(shí)間浸泡。
2.本方法標(biāo)準(zhǔn)曲線有輕微的非線性,因而不能用Beer 定律進(jìn)行計(jì)算,而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來
測(cè)定
3.比色順序從蛋白濃度低的管開始,中間不必清洗比色杯,以免影響結(jié)果。
4.疏水蛋白或粘蛋白,可能與染料發(fā)生沉淀,加入等體積1N NaOH 可以消除。
5.如果知道樣品的蛋白大體濃度,可以采用相近的3 管做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
6. 由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此Bradford 法用于不同蛋白
質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的
偏差,在制作 標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用 g—球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì),以減少這方面的偏差。
7. 有一些物質(zhì)干擾此法的測(cè)定,主要的干擾物質(zhì)有:去污劑、 Triton X-100 、十二烷基硫
酸鈉(SDS )和 0.1N
的NaOH。(如同0.1N 的酸干擾Lowary 法一樣)。

 

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